Trong những năm gần đây, nhờ sự phát triển vƣợt bậc của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là công nghệ gen, đã giúp các nhà khoa học tiến những bƣớc dài trong việc tím hiểu nguyên nhân và cơ chế phát sinh ung thƣ. Dƣới đây là một số các kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử thƣờng đƣợc dùng để xác định đột biến gen trong các loại ung thƣ nói chung và ung thƣ đại trực tràng nói riêng.
PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism).
Trong sinh học phân tử, sự đa hính chiều dài các đoạn giới hạn (RFLP) thƣờng đề cập đến sự khác biệt giữa hai hoặc nhiều mẫu ADN tƣơng đồng, phát sinh ở những khu vực khác nhau, ở những vị trì giới hạn. Nguyên lì cơ bản của phƣơng pháp này là dựa vào tình chất của enzyme giới hạn, có thể nhận biết một
trính tự ADN đặc hiệu để cắt đoạn ADN thành các mảnh nhỏ có chiều dài khác nhau. Các mảnh giới hạn này sau đó đƣợc phân tách theo chiều dài của chúng bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose và đƣợc chuyển qua màng bằng phƣơng pháp lai Southern blot. Trên màng có những probe ADN để xác định những đoạn ADN giới hạn có thể bắt cặp bổ sung với probe. RFLP xảy ra khi chiều dài của các đoạn giới hạn khác nhau ở những mẫu khác nhau. Mỗi đoạn giới hạn đó đƣợc gọi là một alen và có thể dùng để phân tìch di truyền. Phân tìch RFLP thƣờng đƣợc hỗ trợ bằng kĩ thuật PCR để khuếch đại đoạn gen cần phân tìch. Chình ví thế, kĩ thuật này thƣờng đƣợc gọi là PCR-RFLP. Tùy theo mục đìch và dựa vào đặc điểm của gen cần nghiên cứu, ngƣời ta có thể thực hiện phƣơng pháp PCR-RFLP theo các cách khác nhau, có thể đơn giản hóa hoặc tiến hành cùng một số phƣơng pháp khác
[24,34].
SSCP (Single strand conformation polymorphism)
Một phƣơng pháp đơn giản khác đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đột biến điểm là phân tìch đa hính cấu hính sợi đơn (SSCP) của phân tử ADN. Cấu trúc không gian 3 chiều của phân tử ADN sợi đơn đƣợc xác định bởi trính tự và môi trƣờng chứa chúng. Do đó, trong trƣờng hợp điều kiện môi trƣờng không thay đổi, cấu trúc của chúng chỉ phụ thuộc vào trính tự nucleotide và bất cứ thay đổi nào trong đó cũng làm thay đổi cấu hính sợi đơn. Khi điện di trên gel polyacrylamide không biến tình, các cấu hính khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và phân tách ra. Những yếu tố khác ảnh hƣởng đến cấu hính sợi đơn nhƣ nhiệt độ, pH, đệm chạy có thể đƣợc sử dụng để tăng khả năng phân tách. Nhín chung, nhiệt độ và pH thấp giúp duy trí cấu hính và dễ dàng phân biệt đƣợc các phân tử ADN có trính tự khác nhau [28, 29].
DHPLC (denaturing high performance liquid chromatography)
Đây là phƣơng pháp phân tìch ADN dị sợi kép. Thay ví sử dụng gel và phân tách ADN bằng điện di, ADN đƣợc phân tách bằng sắc ký HPLC. Các mạch ADN đƣợc phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau và hính thành ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chình xác. Các phân tử dị sợi
kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bính thƣờng. DHPLC là một kĩ thuật mạnh, đơn giản và mẫu đƣợc đƣa vào tự động. Với những tiến bộ gần đây trong việc phát triển phần mềm dự đoán đƣờng cong biến tình, phƣơng pháp này có độ nhạy cao và khả năng tái sử dụng tốt. Trở ngại duy nhất của nó là những hạn chế khi đƣa mẫu vào hệ thống [26, 27].
Realtime PCR
Trong sinh học phân tử, đây là kĩ thuật PCR mà kết quả khuếch đại ADN đƣợc hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Kĩ thuật này cho phép phát hiện và định lƣợng tuyệt đối số lƣợng bản sao của một hay nhiều trính tự cụ thể của một mẫu ADN. Hai phƣơng pháp để định lƣợng là nhuộm huỳnh quang không đặc hiệu với trính tự ADN kép và lai sản phẩm với một đầu dò ADN đặc hiệu có gắn huỳnh quang. Qua mỗi chu kí của phản ứng, lƣợng sản phẩm tăng lên dẫn đến sự gia tăng tỉ lệ phát huỳnh quang. Qua đó có thể dựa vào số đo huỳnh quang để định lƣợng chình xác lƣợng sản phẩm. Đây đƣợc coi là hƣớng tiếp cận mới so với PCR chuẩn, đƣợc sử dụng nhiều trong cả khoa học cơ bản và trong chẩn đoán, dùng để xác định cách thức biểu hiện di truyền của một gen đặc biệt thay đổi theo thời gian hoặc nhanh chóng phát hiện acid nucleic trong mẫu cần chẩn đoán nhƣ mẫu ADN của tác nhân gây bệnh truyền nhiễm, ung thƣ, đột biến điểm hay những bất thƣờng di truyền [19].
Giải trình tự [58].
Giải trính tự của gen tức là phát hiện đƣợc thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotide A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine) trên phân tử DNA. Các phƣơng pháp giải trính tự gene:
Phƣơng pháp hóa học giải trính tự DNA: Nguyên tắc của phƣơng pháp này là: (1) Trƣớc hết là phải đánh dấu một đầu của đoạn DNA cần phải giải trính tự bằng một gốc phospho đồng vị phóng xạ (32P).
(2) Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu này với chất hóa học có thể làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên đoạn DNA. Dùng 4 ống nghiệm và
các chất hóa học nêu trên để mỗi ống nghiệm chỉ có chứa các đoạn DNA mà trên mỗi đoạn DNA này chỉ có một vị trì nucleotide đặc hiệu với chất hóa học là bị biến đổi.
(3) Các nucleotide bị biến đổi này sẽ bị lấy ra khỏi mạch khung đƣờng-phosphate của đoạn DNA và nhờ đó tách ra đƣợc các đoạn mạch đơn có một đầu đánh dấu 32P và một đầu bị mất phân tử base ví phân tử này đã bị lấy ra khỏi mạch khung.
(4) Thực hiện điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghiệm này trên 4 hàng của một gel polyacrylamide biến tình để các mạch đơn trong mẫu di chuyển trong gel không bị biến đổi trong quá trính điện di. Nhờ đó, sau khi hoàn tất điện di, các mạch đơn sẽ bị dừng tại các vị trì khác nhau, tùy thuộc vào mạch đơn này dài ngắn khác nhau, theo hàng dọc suốt chiều dài của gel. Áp gel đã điện di này trên một phim nhạy tia X, các vị trì dừnglại của các mạch đơn trên gel điện di sẽ tạo thành các vạch trên phim ví các vị trì này đều bị đánh dấu phóng xạ do các mạch đơn đều có một đầu đƣợc đánh dấu bằng 32P. Từ các vạch trên phim xạ ký tự ghi này (autoradiography), có thể đọc đƣợc trính tự của các nucleotide của đoạn DNA
Phƣơng pháp hóa học xác định trính tự DNA của Maxam và Gilbert trên thực tế không phải dễ thực hiện ví cần phải xác định khá nhiều thông số tối ƣu cho thì nghiệm, trong đó khó nhất là phải xác định đƣợc nồng độ giới hạn nhất của các chất hóa học sao cho khi xử lý mẫu DNA thí trên mỗi đoạn DNA chỉ có một base bị biến đổi để ứng với mỗi vị trì của base bị biến đổi thí sẽ có một mạch đơn có đầu đánh dấu 32P đƣợc tách ra. Chình ví sự phức tạp này, phƣơng pháp Maxam Gilbert hiện nay ìt đƣợc sử dụng, mà thay vào đó các nhà khoa học dùng phƣơng pháp enzyme với nhiều ƣu điểmvƣợt trội hơn
Phƣơng pháp enzyme giải trính tự DNA (phƣơng pháp dideoxyribonuleotide). Nguyên tắc chung của phƣơng pháp này có thể tóm tắt nhƣ sau:
(1) Chèn các đoạn DNA cần phải xác định trính tự vào một vector là phage hay plasmid tại một vị trì mà trính tự chuỗi của vị trì này đã đƣợc xác định rõ. Đƣa các vector mang đoạn chèn DNA này vào tế bào vi khuẩn để nhân bản các vector này
thành nhiều bản sao, sau đó tách chiết và tinh khiết các vector từ vi khuẩn để thành các vector tự do.
(2) Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trính tự của vector tại vị trì chèn đoạn DNA. Thêm vào ống DNA polymerase và 4 loại nucleotide tự do (dNTP) và một lƣợng rất giới hạn loại nucleotide ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate. Phản ứng đƣợc thực hiện trong 4 ống, và mỗi ống cho một loại ddNTP khác nhau. Các mạch đơn bổ sung với mạch DNA sẽ đƣợc tổng hợp trên vector, và sự tổng hợp mạch đơn sẽ bị dừng lại tại vị trì mà ddNTP đƣợc bổ sung vào thay cho dNTP. Lý do sự tổng hợp bị dừng lại là ví ddNTP có cấu trúc hóa học bị mất đi gốc OH tại vị trì carbon thứ 3 của đƣờng deoxyribose, mà gốc OH tại vị trì này chình là nơi để dNTP kế tiếp đƣợc gắn vào. Nhờ vậy trong ống phản ứng có các mạch đơn DNA có các chiều dài khác nhau tƣơng ứng với các vị trì trính tự các nucleotide trên đoạn DNA gốc
(3) Điện di trên gel polyacrylamide biến tình để xác định trính tự của đoạn gen. Do mồi đƣợc đánh dấu hay dNTP đƣợc đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ 32P hay 35S nên sau khi điện di các vạch điện di đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật xạ ký tự ghi, và từ các vạch này giải đƣợc trính tự của đoạn DNA.
PCR đã đóng góp rất nhiều vào công nghệ giải trính tự làm cho công nghệ giải trính tự ngày càng dễ dàng hơn và thuận tiện hơn nhằm ứng dụng không chỉ trong nghiên cứu mà cả trong chẩn đoán. Chỉ cần dùng PCR là có thể nhân bản đoạn gene muốn giải trính tự thành hàng tỷ bản sao hoàn toàn giống hệt nhau và sản phẩm khuếch đại này có thể đƣa vào giải trính tự trực tiếp mà không cần phải chèn vào một plasmid giải trính tự nữa [58].
Ngày nay, phƣơng pháp giải trính tự tự động đƣợc áp dụng rộng rãi ở các phòng thì nghiệm trên thế giới nhƣng cơ bản vẫn áp dụng nguyên lý nhƣ trên. Với sự phát triển của các enzyme ADN polymerase và các hợp chất hóa học, phƣơng pháp này cho phép sàng lọc SNPs hiệu quả rất cao khi so sánh với các kỹ thuật đã miêu tả trên. Cho đến nay, nó đã đƣợc cải tiến thành giải trính tự tự động và sử dụng chất huỳnh quang, cho phép xác định chình xác các điểm đột biến trên cả một
thông tin về điểm đột biến nhƣ: loại đột biến, vị trì, hậu quả. Tuy nhiên, nó có hạn chế là đòi hỏi sản phẩm khuếch đại ADN phải có độ tinh sạch rất cao và các hóa chất, thiết bị đắt tiền [58].