2.5.2.1. Tỷ lệ thụ tinh (FR):
Tỷ lệ thụ tinh (%) = Số trứng thụ tinh
Tổng số trứng thu mẫu× 100
2.5.2.2. Tỷ lệ nở (HR): Tỷ lệ nở là tỷ lệ phần trăm giữa số lượng cá bột nở ra trên tổng số trứng đã được thụ tinh. Để xác định tỷ lệ nở, trứng sau khi được thụ tinh được tổng số trứng đã được thụ tinh. Để xác định tỷ lệ nở, trứng sau khi được thụ tinh được chuyển vào cốc 250ml và được sục khí nhẹ. Sau khi cá nở hoàn toàn, đếm số cá trong các cốc thí nghiệm, tính tỷ lệ nở (HR) theo công thức:
HR(%) = Số cá nở ra
Tổng số trứng được thụ tinh× 100
2.5.2.3. Quan sát sự phát triển của phôi: Việc thu trứng được tiến hành ngay sau khi cá đẻ 15 – 20 phút (đảm bảo quá trình thụ tinh xảy ra). cá đẻ 15 – 20 phút (đảm bảo quá trình thụ tinh xảy ra).
Dụng cụ thí nghiệm:
Lọ nhựa thể tích 3-5 L
2 dây và đá sục khí
Pipet hoặc dụng cụ lấy trứng để quan sát, lam kính, hộp lồng.
Kính hiển vi, máy ảnh
Nước ngọt
Lấy mẫu trứng cá đã thụ tinh: Cứ sau 30 phút thu mẫu trứng 1 lần để xác định các giai đoạn phát triển của phôi bằng kính hiển vi, ghi hình bằng máy ảnh kỹ thuật số.
Thời gian phát triển phôi được tính từ lúc trứng thụ tinh cho tới khi trứng nở.
Theo dõi khả năng vận động của ấu trùng trong 1 phút.
Tốc độ sinh trưởng đặc trưng về chiều dài (SGRL)
SGR (%/ngày) = ( ) − ( )
− ∗ 100
Trong đó: L1 là chiều dài cá (mm) trung bình tại thời điểm t1. L2 là chiều dài cá (mm) trung bình tại thời điểm t2.
Tỷ lệ sống (%)
TLS(%) = × 100
Trong đó: X là số lượng cá tại thời điểm kết thúc thí nghiệm. Y là số lượng cá ban đầu.
Kiểm tra tốc độ sinh trưởng, tỷ lệ sống định kỳ 5 lần / ngày.
2.6. Xử lý số liệu
Các số liệu sau thu thập được xử lý bằng phương pháp thống kê sử dụng phần mềm Microsoft Excel và SPSS phiên bản 16.0. Các giá trị trung bình được so sánh theo phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (One - Way Anova). Sử dụng phép kiểm định thống kê Ducan để xác định sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa P < 0,05. Tất cả các số liệu trong thí nghiệm được trình bày dưới dạng Trung bình (Mean) ± Sai số chuẩn (SE).
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Một vài đặc điểm sinh học sinh sản 3.1.1. Phân biệt cá đực, cá cái 3.1.1. Phân biệt cá đực, cá cái
Việc phân biệt cá sọc ngựa đực cái bằng hình thái bên ngoài có ý nghĩa quan trọng trong tuyển chọn và sinh sản nhân tạo loài cá này. Cá sọc ngựa giai đoạn còn nhỏ rất khó phân biệt giới tính, đặc biệt là khi cá chưa thành thục sinh dục bởi chúng rất giống nhau. Khi thành thục, cá sọc ngựa có thể phân biệt được đực cái khá dễ dàng thông qua những dấu hiệu hình thái và màu sắc cơ thể cá như sau:
Hình 3.1 Hình dạng cá đực Hình 3.2 Hình dạng cá cái
Cá đực (hình 3.1): Hình dạng cơ thể cá đực thuôn và mảnh hơn so với cá cái. Bụng thon hơn cá cái. Cá đực có xu hướng vận động, bơi lội nhanh, linh hoạt và chủ động hơn so với cá cái. Cơ thể có màu ánh vàng sáng hơn đặc biệt là phần phía dưới bụng. Vây bụng của cá đực có màu vàng sáng.
Cá cái (hình 3.2): Cá cái có nhiều đặc điểm khác biệt hơn so với cá đực, đặc biệt là khi thành thục bụng của nó to hơn rất nhiều do chứa trứng. Hình dạng và khối lượng cá cái to hơn cá đực. Cá cái có xu hướng di chuyển chậm hơn so với cá đực. Các sọc dọc theo cơ thể có màu xanh đậm hơn. Vây bụng có màu xanh đậm.
3.1.2. Các giai đoạn phát triển của buồng trứng
Buồng trứng cá sọc ngựa là một tuyến đôi gồm 2 nhánh có hình túi, dài nằm trong xoang bụng và treo lên vách xoang cơ thể nhờ màng treo buồng trứng. Hai nhánh này nằm hai bên ruột và ở dưới bóng hơi. Hai nhánh của buồng trứng phát triển đồng đều, ít chênh lệch nhau về kích thước.
Trong quá trình nuôi, hàng tuần tiến hành kiểm tra mẫu để phân tích xác định khả năng phát dục của cá. Do thời gian nghiên cứu còn ngắn nên chưa thu được mẫu buồng trứng ở giai đoạn I và VI, mà chỉ mới thu được buồng trứng ở giai đoạn II, III, IV và V.
Giai đoạn II
Buồng trứng gia tăng về kích thước và phân thùy rõ rệt, chiếm 1/3 đến 1/4 thể tích khoang bụng. Buồng trứng vẫn trong suốt. Dọc theo buồng trứng là một mạch máu lớn có những nhánh nhỏ. Ở giai đoạn này, bằng mắt thường chưa phân biệt được hạt trứng nhưng qua kính lúp có thể thấy rõ ràng từng hạt trứng, chúng trong suốt và hầu như không màu. Và phân biệt được đực cái do có thể phân biệt được tuyến sinh dục đực và tuyến sinh dục cái bằng mắt thường
Giai đoạn III
Buồng trứng có sự tăng trưởng mạnh về kích thước của từng hạt trứng cũng như cả buồng trứng, chiếm 1/3 đến 1/2 thể tích xoang bụng. Các hạt trứng không còn trong suốt mà chuyển sang màu đục. Màu của buồng trứng cũng đậm hơn. Kích thước noãn bào tăng nhanh không chỉ do quá trình tăng thể tích nguyên sinh chất mà còn do quá trình tạo noãn hoàng, có thể thấy rõ các hạt trứng bằng mắt thường. Nếu cắt buồng trứng và dung đầu kéo để lấy ra những hạt trứng riêng, thì trứng khó tách ra khỏi những vách ngăn bên trong của buồng trứng và luôn kết thành từng chùm gồm nhiều hạt.
Giai đoạn IV
Tuyến sinh dục có kích thước lớn, chiếm gần hết xoang bụng, kích thước hạt trứng đạt tối đa. Các hạt trứng to, lực liên kết giữa các tế bào trứng giảm làm trứng có xu thế tách rời nhau ra. Ở giai đoạn này ta có thể dễ dàng tách từng hạt trứng ra riêng rẽ. Buồng trứng có màu trắng đục.
Giai đoạn V
Giai đoạn đẻ trứng, nhìn bên ngoài bụng cá to, thành bụng mềm, lỗ sinh dục to và hơi lồi ra. Buồng trứng căng tròn, có màu trắng đục. Lúc này nếu vuốt nhẹ vào bụng cá, trứng sẽ theo lỗ sinh dục chảy ra ngoài.
3.1.3. Ảnh hưởng của thức ăn lên hệ số thành thục (GSI)
Khi sinh trưởng và phát triển đạt đến kích thước – khối lượng nhất định và đến tuổi thành thục lúc này tuyến sinh dục mới chín muồi để cá tiến hành tham gia sinh sản duy trì quần thể tự nhiên của loài. Hệ số thành thục (GSI) cho ta biết sự chín muồi của sản phẩm sinh dục nhưng không phản ánh đầy đủ trạng thái thực của sản phẩm sinh dục song dù sao hệ số thành thục cũng là một phần quan trọng bổ sung cho sơ đồ chín muồi sinh dục.
Từ kết quả nghiên cứu thu được cho thấy, khi cho cá sọc ngựa ăn 3 loại thức ăn khác nhau thì cho hệ số thành thục tăng liên tục theo các tháng và cao nhất ở tháng 3, kế tiếp là tháng 5 và tháng 4. Do thời gian làm thí nghiệm ngắn, mặt khác lại tiến hành nuôi cá trong phòng thí nghiên nên chưa đủ cơ sở để kết luận về mùa vụ sinh sản của cá sọc ngựa.
Hình 3.3. Biến động hệ số thành thục của cá sọc ngựa
Trong thí nghiệm này, sau khi phân tích phương sai 1 yếu tố cho thấy, khi cho các sọc ngựa ăn 3 loại thức ăn khác nhau thì hệ số thành thục của nó cũng khác nhau, sự sai khác này là có ý nghĩa với p < 0.05 (bảng 1 phần phụ lục). Điều này chứng tỏ thức ăn có ảnh hưởng tới sự thành thục của cá, cụ thể là khi cho cá ăn bằng trùn chỉ thì cho hệ số thành thục cao nhất (10.34 ± 44.721a %), tiếp đó là hệ số thành thục của cá ăn thức ăn tổng hợp kết hợp trùn chỉ (8.94 ± 34.595b %) và thấp nhất là hệ số thành thục của cá ăn thức ăn tổng hợp (7.17 ± 57.770c %).
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00
Dec-13 Jan-14 Feb-14 Mar-14 Apr-14 May-14
H ệ số th à n h t h ụ c G S I (% ) Tháng thu mẫu TH TH+TC TC
3.1.4. Ảnh hưởng của thức ăn lên sức sinh sản tương đối và sức sinh sản tuyệt đối
Sức sinh sản của mỗi loài biểu hiện sự thích nghi của loài đối với điều kiện sinh sản, liên quan đến sự phát triển, tồn vong của loài. Sức sinh sản là một trong những chỉ tiêu quan trọng trong sinh sản nhân tạo. Dựa vào đó người ta có thể chủ động lập được kế hoạch sinh sản phù hợp như xác định được số lượng cá bố mẹ cần cho mục đích sinh sản, đồng thời dự đoán được số lượng cá bột.
Thông qua việc giải phẫu cá để thu tuyến sinh dục ở giai đoạn IV và đếm trứng ta có được sức sinh sản tuyệt đối và sức sinh sản tương đối của cá của cá khi tiến hành thí nghiệm cho ăn với 3 kiểu cho ăn khác nhau theo bảng sau:
Bảng 3.1. Sức sinh sản của cá sọc ngựa khi cho ăn 3 loại thức ăn khác nhau
Loại thức ăn BW (g) tb GW (g) tb AF RF
Tổng hợp 0,580±0,0866 0,044±0,0099 231±12,91a 413±25,33a Tổng hợp + Trùn chỉ 0,694±0,1219 0,067±0,0208 366±9,99b 523±17,91b Trùn chỉ 0,790±0,0781 0,084±0,0115 484±16,68c 617±18,89c
Các ký hiệu chữ cái a,b,c trong cùng một cột chỉ sự sai khác về mặt thống kê (P<0,05). Số liệu
được trình bày dưới dạng TB (mean) ± SE.
Trong nghiên cứu này, cá sọc ngựa bố mẹ có khối lượng từ 0,481 ÷ 0,782 gam/con. Sức sinh sản của cá tỷ lệ thuận với khối lượng.
Sức sinh sản tuyệt đối của cá sọc ngựa cao nhất ở thí nghiệm cho cá ăn trùn chỉ 484 ± 63c trứng, và thấp nhất là ở thí nghiệm cho cá ăn bằng thức ăn tổng hợp 231 ± 52a trứng. Kết quả này tương tự với kết quả quan trắc sức sinh sản tương đối của cá sọc ngựa trong các điều kiện thức ăn khác nhau. Theo đó sức sinh sản tương đối của cá sọc ngựa cao nhất ở thí nghiệm cho cá ăn trùn chỉ 617±65c trứng/ cá cái, và thấp nhất là ở thí nghiệm cho cá ăn bằng thức ăn tổng hợp 413 ± 25a trứng/ cá cái. Kết quả phân tích phương sai 1 yếu tố chỉ ra rằng thức ăn có ảnh hưởng tới sức sinh sản của cá và khi cho cá các loại thức ăn khác thì sức sinh sản của cá cũng khác nhau (bảng 2, bảng 3 phần phụ lục).
3.2. Thử nghiệm sinh sản nhân tạo 3.2.1. Chăm sóc cá bố mẹ 3.2.1. Chăm sóc cá bố mẹ
Cá đực cá cái được nuôi ở các ô thí nghiệm khác nhau với mật độ 30 con/ 6 lít nước [8]. Nước sử dụng để nuôi cá là nước máy do đó cần sục khí 1 ngày (để khử clorine) trước khi thả cá. Chất lượng nước là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sức khỏe, khả năng sinh trưởng của cá. Chất lượng nước kém có thể dẫn việc cá bị stress và làm giảm khả năng sinh sản của cá [7, 28]. Bể nuôi cá được thiết kế có hệ thống lọc nước tuần hoàn, nhằm loại bỏ chất thải, giảm các yếu có khả năng gây bệnh cho cá. Bể nuôi cá cũng có hệ sục khí liên tục 24/24 giờ, đảm bảo cung cấp đủ oxy cho cá.
Về nhiệt độ, mặc dù cá sọc ngựa là một loài rộng nhiệt, ngoài tự nhiên cá sọc ngựa có thể sống được ở những nơi có nhiệt độ thấp 6oC vào mùa đông và những nơi có nhiệt độ cao lên tới 38oC vào mùa hè [47]. Trong nghiên này, cá sọc ngựa được nuôi ở nhiệt độ khoảng 26oC – 28oC. Đây được xem là nhiệt độ lý tưởng cho cá sinh trưởng và phát triển [8, 55].
Vệ sinh bể nuôi cá: duy trì bể nuôi cá và hệ thống lọc nước sạch sẽ là yếu tố quan trọng giúp cá khỏe mạnh [8]. Cá sọc ngựa thường xuyên tiết ra amoniac (qua mang và phân thải) ra môi trường xung quanh, cùng với sự phân hủy thức ăn dư thừa sẽ làm ô nhiễm nước và có ảnh hưởng xấu tới sức khỏe của cá. Trong quá trình nuôi cá thí nghiệm, 1 ngày siphon đáy 1 lần và thay 1/3 nước. Nước dùng để thay hàng ngày phải được phơi hoặc sục khí khử clorine trước khi dùng. Lưới lọc 1 ngày giặt một lần.
Cá được cho ăn bằng 3 loại thức ăn khác nhau: tổng hợp, tổng hợp và trùn chỉ, trùn chỉ. Mỗi ngày cho cá ăn 2 lần; với cá ăn thức ăn tổng hợp thì mỗi lần cho cá ăn 0.0784 gam thức ăn/1gam khối cá; với cá cho ăn thức ăn tổng hợp kết hợp trùn chỉ thì buổi sáng cho cá ăn 0.0620 gam thức ăn tổng hợp/ 1 gam khối lượng cá và buổi chiều cho cá ăn 0.1873 gam trùn chỉ/ 1 gam khối lượng cá; với cá ăn trùn chỉ thì mỗi lần cho cá ăn 0.1604 gam trùn chỉ/ 1 gam khối lượng cá. Thường xuyên theo dõi vân động, khả năng bắt mồi của cá để điều chỉnh chế độ cho ăn và thay nước thích hợp. Mỗi lần cho cá ăn từ 5 – 10 phút, cho cá ăn từng ít một đến khi thấy cá no không muốn ăn nữa thì dừng lại. Trong khi cho cá ăn, tắt hệ thống lọc nước tuần hoàn trước và sau khi cho 5 phút.
3.2.2. Tuyển chọn cá bố mẹ cho sinh sản
Trước khi tiến hành cho cá đẻ, ta phải giải phẫu một số mẫu cá xem độ thành thục của cá ở mức nào để có thể đạt được hiệu quả sinh sản tốt nhất. Và tuyển chọn cá bố mẹ dựa vào hình thái bên ngoài, màu sắc, tình trạng sức khỏe.
Màu sắc, hình thái bên ngoài: Cá khỏe mạnh, bơi lội lanh lẹ, màu sắc cơ thể tươi sáng, bóng bẩy. Vây, vẩy còn nguyên vẹn, ít bị xây sát, thương tật. Không nên chọn những con bị xây xát, xước vẩy. Riêng cá cái, chọn những con bụng to, mềm, có lỗ sinh dục hơi lồi ra.
3.2.3. Bố trí thí nghiệm cho cá đẻ
Ở mỗi lô thí nghiệm ta chọn ra 5 con cái và 10 con đực, tỷ lệ 1:2 nhằm tăng hiệu quả thụ tinh. Chuyển cá vào các bể đã được bọc nilon đen và rải 2 lớp bi dưới đáy. Sục khí liên tục đảm bảo cung cấp đủ lượng Oxy cho cá.
Thả cả cá đực và cá cái chung vào 1 bể đẻ khoảng 24 tiếng trước khi cho cá đẻ [55]. Che kín bể bằng túi nilon đen, không cho ánh sáng lọt vào. Vào buổi sáng sớm, khi trời bắt đầu sáng thì mở nắp túi nilon ra cho cá cái và cá đực nhìn thấy nhau vào thực hiện hành vi sinh sản. Sau khoảng 15-20 phút thì tách riêng cá cái và cá đực ra, cho cá bố mẹ ăn và thu trứng trong bể đẻ.
Cách thu trứng: Trứng cá sọc ngựa sau khi đẻ ra sẽ lắng xuống đáy bể, ta dùng ống dây nhựa hút trứng ra khay nhựa (thực hiện giống như siphon đáy). Tiến hành tách, đếm trứng đã được thụ tinh và trứng không được thụ tinh.
Sau khi thu hết trứng, ta rửa sạch bi, chuẩn bị bể đẻ và thả cá bố mẹ vào lại. Mỗi đợt cho đẻ, ta thực hiện cho cá đẻ liên tục 3 đến 4 lần tương đương với 3 đến 4 ngày. Cá sọc ngựa là loại cá đẻ hàng loạt, khi điều kiện thuận lợi, cá đã thành thục sinh dục có khả năng đẻ trứng hàng ngày trong 1 đợt sinh sản [10]. Eaton và Farley đã phát hiện ra rằng cá cái có thể đẻ trứng 1,9 ngày một lần nếu được tiếp xúc liên tục với cá đực [18]. Trong nghiên cứu của mình, Spence và Smith thấy rằng cá Sọc Ngựa là loài cá đẻ tái phát sau ít nhất là 12 ngày. Khoảng thời gian này có thể kéo dài hơn nếu điều kiện môi trường (chất lượng nước, chế độ ăn uống…) không được thuận lợi hoặc cá cái được sử dụng cho sinh sản thường xuyên [48].
3.2.4. Các giai đoạn phát triển của phôi
Trong thí nghiệm này, trứng cá sọc ngựa được thụ tinh ở nhiệt độ 27oC, trứng cá sẽ nở sau khoảng 39 giờ. Quá trình phát triển phôi của cá sọc ngựa được trình bày ở