1.3.1.1. Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tơm của Pháp [4]
To = 65oC, t = 2h w/v = 1/10 NaOH 3.5% To phịng, t = 2h w/v = 1/10 T = 30 phút HCl 1N To phịng, t = 6 phút To phịng w/v = 1/10 NaOCl 0.135% To = 850C. t= 4h w/v = 1/4 NaOH 40%
Hình 1.4. Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tơm của Pháp
Chitosan deacetyl Hấp chin, phơi khơ
Rửa trung tính Rửa trung tính Ngâm NaOCl Xay nhỏ Ngâm aceton Ngâm HCl Rửa trung tính Tách protein Vỏ tơm
Ưu điểm: Quy trình sản xuất này rút ngắn được thời gian sản xuất rất nhiều tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm cao. Chưa kể đến các yếu tố an tồn.
Sản phẩm thu được rất sạch cĩ màu trắng đẹp do đã khử được sắc tố triệt để. Nhược điểm: Do NaOCl là một chất oxy hĩa mạnh nên ảnh hưởng đến mạch polymer làm cho độ nhớt của sản phẩm giảm một cách rõ rệt. Mặt khác, aceton rất đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm cao. Chưa kể đến các yếu tố an tồn sản xuất cơng nghệ này khĩ áp dụng trong điều kiện sản xuất cơng nghệ này khĩ áp dụng trong điều kiện sản xuất của nước ta hiện nay.
1.3.1.2. Quy trình của Đỗ Minh Phụng - Đại học Thủy sản Nha Trang (1980) [4]
HCl 6N T0 phịng, t = 48h w/v = 1/2.5 NaOH 8 % T0 = 1000C, t =2h w/v = 1/ 2.5 NaOH 40% T0 = 800C, t = 24h w/v = 1/1
Hình 1.5. Quy trình của Đỗ Minh Phụng, trường Đại học Thủy sản Nha Trang
Vỏ tơm Ngâm HCl Rửa trung tính Chitosan Chitin Rửa trung tính Ngâm NaOH Rửa trung tính Nấu trong NaOH
Nhận xét: Chitin thu được cĩ độ trắng cao mặc dù khơng cĩ cơng đoạn tẩy màu. Tuy nhiên, lại cĩ nhược điểm là thời gian sản xuất kéo dài, tiêu tốn nhân cơng, nồng độ hĩa chất sử dụng cao kết hợp với thời gian xử lý dài (cơng đoạn khử khống) làm cắt mạch polymer trong mơi trường axit dẫn đến độ nhớt giảm
1.3.2. Sản xuất chitin - chitosan bằng phương pháp sinh học.
1.3.2.1. Quy trình sử dụng enzyme flavourzyme trong cơng nghệ sản xuất Chitin từ phế liệu tơm (Trang Sĩ Trung và cộng sự, 2007)
E/S: 0.1% Thời gian 6h Nhiệt độ 500C pH = 6.5
Hình 1.6. Quy trình sử dụng enzyme flavourzymetrong cơng nghệ sản xuất chitin từ phế liệu tơm (Trang Sĩ Trung và cộng sự, 2007)
Phế liệu tơm Xay nhỏ (0,5-0,6cm) Rửa trung tính Khử protein cịn lại bằng NaOH lỗng Thu dịch protein astaxanthin Rửa trung tính Khử protein bằng enzyme Khử khống bằng HCl Chitin
Các enzyme tripsin, pepsin và papain cũng được nghiên cứu để thủy phân carotenoprotein từ vỏ tơm Metapenaeus monoceros (Chakrabarti, 2002). Kết quả cho thấy, trypsin cĩ hiệu suất thu hồi carotenoid cao nhất là 55% trong 4 giờ ở 280C, pepsin và papain chỉ thu được 50%.
Tĩm lại, cĩ nhiều nghiên cứu và triển khai thử nghiệm sử dụng enzyme protease để thủy phân protein trong quá trình sản xuất chitin từ phế liệu thủy sản.
Tuy nhiên, các triển khai này chủ yếu ở qui mơ nhỏ, thử nghiệm, đang trên quá trình hồn thiện quy trình.
1.3.3. Sản xuất chitin - chitosan bằng phương pháp sinh học và phương pháp kết hợp sinh học với hĩa học. kết hợp sinh học với hĩa học.
1.3.3.1. Quy trình sản xuất chitin ứng dụng papain để khử protein (Trần Thị Luyến, 2000). [4]
Hình 1.7. Quy trình sản xuất chitin ứng dụng papain để khử protein (Trần Thị Luyến, 2000)
Vỏ tơm khơ Vỏ tơm tươi
Ngâm HCl 10%, tỷ lệ 1/10, t0C phịng,5h
Khử protein bằng papain 13%, tỷ lệ 1/5; pH = 5-5,5; T0C= 70-800C; 4h
Rửa sạch, tẩy, làm khơ ở 600C
Rửa sạch
Ngâm HCl 10%, tỷ lệ 1/5, t0C phịng,5h
Trong quy trình này, quá trình khử protein được thực hiện bằng enzyme papain để thay thế xử lý bằng NaOH. Việc sử dụng papain cho phép hạn chế ơ nhiễm mơi trường, lượng papain dồi dào thu nhận từ thực vật. Ngồi ra, protein trong dịch thủy phân cĩ thể sử dụng bổ sung vào thức ăn gia súc.
1.4. Cơ chế, phương pháp khử khống và các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả khử khống và chất lượng của chitin
1.4.1. Phương pháp, và cơ chế khử khống [9]
Phương pháp:
Trong vỏ tơm thành phần khống chủ yếu là CaCO3 và Ca(PO4). Nên người ta thường dùng các axit như HCl, H2SO4, EDTAvà các axit hữu cơ khác như axit formic, axit lactic, axit axit để khử khống.
Phương pháp khử khống bằng EDTA chỉ được thử nghiệm ở quy mơ nhỏ, chưa được áp dụng trên quy mơ cơng nghiệp vì EDTA là một trong các hĩa chất tương đối đắt tiền. Đối với phương pháp khử khống bằng axit hữu cơ thì một số nghiên cứu gần đây mới sử dụng, ở các nghiên cứu này nồng độ xử lý thường dưới 1M đối với axit formic và axit lactic.
Tuy nhiên trong sản xuất chitin, việc thực hiện cơng đoạn khử khống thường được thực hiện bằng axit HCl vì tính thơng dụng của nĩ cộng với khả năng khử khống của HCl tương đối cao.
Cơ chế:
Khi khử khống, nếu dùng HCl thì hiệu quả cao hơn. Nếu dùng H2SO4 thì sẽ tạo muối khĩ tan khi lưu chuyển nước ngâm chậm. phản ứng HCl khử khống diễn ra như sau:
CaCO3 + HCl = CaCl2 + CO2 + H2O CaPO4 + 6HCl = 3CaCl2 + 2H3PO4
1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả khử khống
Nồng độ axit ảnh hưởng lớn đến chất lượng sản phẩm chitin sau này, đồng thời nĩ ảnh hưởng tới thời gian và hiệu quả khử khống. Nồng độ axit cao sẽ rút ngắn được thời gian khử khống nhưng độ nhớt chitin-chitosan giảm nĩ sẽ làm cắt mạch polysaccharide (mạch này bị phân huỷ khi thuỷ phân) dẫn đến chất lượng của chitin - chitosan sau này bị giảm. Ngược lại nếu nồng độ axit thấp thì thời gian khử khống sẽ tăng nhưng ít bị ảnh hưởng, song nếu như nồng độ axit quá thấp thì khử khống sẽ khơng triệt để và thời gian xử lý kéo dài ảnh hưởng tới chất lượng của chitin-chitosan, đồng thời phải kéo dài chu kỳ sản xuất.
Nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến tốc độ khử khống. Nhiệt độ càng cao thì rút ngắn thời gian khử khống. Tuy nhiên ở nhiệt độ cao axit bay hơi gây ơ nhiễm mơi trường, đồng thời nhiệt độ cao nĩ sẽ làm thuỷ phân cắt mạch polysacaride của chitin-chitosan trong mơi trường axit, do đĩ nĩ sẽ làm cho mức độ trùng hợp của polymer chitin giảm, dẫn đến làm giảm độ nhớt của sản phẩm chitosan sau này. Qua nghiên cứu thực tiễn sản xuất người ta thường khử khống ở nhiệt độ phịng.
Tỷ lệ nguyên liệu và dung dịch axit (%) cũng ảnh hưởng tới hiệu quả khử khống. Nếu tỷ lệ này cao thì hiệu quả khử khống thấp do khơng đủ lượng axit cần để phản ứng hết lượng khống cĩ trong nguyên liệu. Nếu tỷ lệ này nhỏ cĩ nghĩa là lượng dịch axit sử dụng cao gây cồng kềnh thí nghiệm, chi phí tốn kém, giảm năng suất dây chuyền, khả năng cắt mạch polymer lớn làm giảm chất lượng chitosan sau này.
1.5. Một số nghiên cứu về quá trình khử khống trong sản xuất chitin
Hiện nay và trước kia cĩ rất nhiều đề tài nghiên cứu quá trình khử khống trong sản xuất chitin sau đây là một số nghiên cứu về quá trình khử khống:
Theo nghiên cứu tối ưu hĩa cơng đoạn khử khống và khử protein của phế liệu tơm thẻ chân trắng sau khi ép trong quy trình sản xuất Chitin – Chitosan của Nguyễn Hồng Vân (2010) [9] đối với phế liệu vỏ tơm thẻ chân trắng:
- Cơng đoạn tối ưu khử khống được tiến hành ở điều kiện: HCl 4%, nhiệt độ 50oC, thời gian 2h, tỷ lệ phế liệu/dung dịch HCl là 1/1,6 (w/v). Mẫu phế liệu sau cơng đoạn tối ưu khử khống cĩ hàm lượng khống 0,9% (hiệu suất khử khống đạt 97,7%) và hàm lượng protein 26,4%.
- Chitin thu được từ quy trình tối ưu cho chất lượng cảm quan tốt về màu sắc. Hàm lượng khống và protein đều nhỏ hơn 1% (tương ứng là 0,8% và 0,8%). Chitosan thu được từ quy trình tối ưu cĩ chất lượng tốt. Màu sắc trắng sáng, hàm lượng khống và protein cịn lại thấp (0,7% và 0,6%). Các chỉ tiêu về độ nhớt, độ deacetyl đạt giá trị khá cao (1141,7cps và 84,8%). Độ tan 99,5% và độ đục 7,7% cho thấy hàm lượng tạp chất trong chitosan thu được là rất thấp.
Nghiên cứu tính chất của Chitin - Chitosan từ phế liệu tơm khử khống bằng axit hữu cơ [10] của Trần Hồi Nhân (2008) cho thấy:
- Khả năng khử khống của các loại axit hữu cơ ( axit lactic. axit formic, axit acetic) cĩ thể so sánh với khả năng khử khống của axit mạnh HCl. Trong các loại axit hữu cơ để sử dụng khử khống thì axit lactic cĩ khả năng khử khống cao nhất
- Tuy hàm lượng khống cịn lại của các mẫu chtitin và chitosan được khử khống bằng axit hữu cơ cao hơn so với sử sụng axit vơ cơ HCl nhưng độ nhớt của chitosan cuae các mẫu khử khống bằng axit hữu cơ cao hơn so với khi khử khống bằng bằng axit HCl. Đồng thời hiệu suất thu hồi chitin – chitosan của axit hữu cơ cao hơn so với khi sử dụng axit HCl để khử khống
CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Vỏ tơm 2.1.1. Vỏ tơm
Vỏ tơm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) thu mua tại khu vực Khánh Hịa được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu
2.1.2. Hĩa chất nghiên cứu.
Các hĩa chất được sử dụng ở dạng tinh khiết loại dùng cho phân tích
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp thu nhận mẫu
Vỏ tơm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) được thu mua tại phân xưởng chế biến của Cơng ty cổ phần Nha Trang Seafoods (F17). Yêu cầu nguyên liệu phải tươi, khơng cĩ mùi lạ, khơng bị biến đỏ, khơng lẫn tạp chất. Nguyên liệu sau khi lấy cho ngay vào thùng xốp cách nhiệt và vận chuyển ngay về phịng thí nghiệm. Nguyên liệu được rửa sạch và sau đĩ mang đi ép bằng thiết bị ép và tiến hành làm thí nghiệm ngay. Trong trường hợp chưa làm thí nghiệm ngay thì rửa sạch, cân và cho vào túi polymer, bảo quản đơng ở điều kiện nhiệt độ -200C cho đến khi sử dụng.
2.2.2. Phương pháp phân tích
2.2.2.1 Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 1050C
Phụ lục 1
2.2.2.2. Xác định hàm lượng khống bằng phương pháp nung 550 – 6000C
Phụ lục 2
2.2.2.3. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Biuret
2.2.2.4. Xác định hiệu quả khử khống
Hiệu quả khử khử khống là tỷ lệ phần trăm của lượng khống tách được so với lượng khống cĩ trong mẫu tương ứng trước khi xử lý, được xác định bằng cơng thức
DA (%) = [(A0*O)-(AR*R)]*100/(A0*O)
Trong đĩ:
DA (%): Hiệu quả khử khống
A0, AR: Hàm lượng khống (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý O, R: Khối lượng (g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý
A0 và AR: Được xác định bằng phương pháp nung ở nhiệt độ 550 – 6000C (phụ lục 2)
2.2.2.5. Xác định hiệu quả khử protein
Hiệu quả khử protein là tỷ lệ phần trăm của lượng protein tách được so với lượng protein cĩ trong mẫu tương ứng trước khi xử lý, được xác định bằng cơng thức:
DP (%) = [(P0*O)-(PR*R)]*100/(P0*O)
P0, PR: Hàm lượng protein (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý O, R: Khối lượng (g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý
2.2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Từ phế liệu ban đầu là vỏ tơm thẻ chân trắng tiến hành rửa sạch rồi đem đi ép ráo nước sau đĩ tiến hành xác định sự ảnh hưởng của loại axit và nồng độ axit đến đến hiệu quả khử khống và protein. Để xác định sự ảnh hưởng của loại axit tiến hành đánh giá với 4 loại axit là HCl, formic, lactic và formic + lactic nồng độ 0.25M trong thời gian 24h với các mốc thời gian là 3h, 7h và 24h. Đối với thí nghiệm nghiên cứ ảnh hưởng của nồng độ axit tiến hành đánh giá ở 3 nồng độ là 0.25M, 0.5M và 1M trong thời gian 3h. Sau đĩ tiến hành kiểm tra hiệu quả khử
Phế liệu vỏ Rửa sạch Ép Xác định ảnh hưởng của loại và nồng độ axit đến hiệu quả khử khống Rửa trung tính Xác định hiệu quả khử protein và khử khống Sấy/ phơi Loại axit (trong 24h) Nồng độ axit (trong 3h)
khống và protein ở các chế độ đĩ để đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố như thời thời gian, nồng độ axit và loại axit đến hiệu quả khử khống và protein
2.2.4.1. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của loại axit và thời gian khử khống đến hiệu quả khứ khống và hiệu quả khử protein khống đến hiệu quả khứ khống và hiệu quả khử protein
Vỏ tơm thẻ chân trắng sau khi ép tiến hành khử khống ở điều kiện: nhiệt độ phịng, tỷ lệ giữa axit và phế liệu là 1/10, axit dùng để khử khống là axit HCl, axit formic, axit lactic, và axit formic + factic tỷ lệ là 1:2, tất cả axit đều ở nồng độ là 0.25M, với thời gian xử lý lần lượt là 0h, 3h, 7h, 24h. Bố trí thí nghiệm được trình bày ở hình 2.2. Các thí nghiệm được lặp 4 lần thành 4 block theo ma trận thí nghiệm ở bảng 2.1.
Hình 2.2: Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của loại axit và thời gian khử khống đến hiệu quả khứ khống và hiệu quả khử protein
Nguyên liệu (vỏ tơm) Xữ lý Ngâm HCl (0,25M) Axit formic (0.25M) formic (0.25M) + lactic(0.25M) Tỷ lệ 1/2 Axit lactic (0.25M) 0h
Ngâm ở nhiệt độ phịng thí nghiệm
Tỷ lệ giữa nguyên liệu và axit là 1/10,.thay dổi thời gian ngâm 24h Rửa trung tính 7h 3h Xác định hiệu quả khử khống và protein Sấy/phơi
Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của loại axit và thời gian khử khống đến hiệu quả khứ khống và hiệu quả khử protein theo Dx
Std Run Block Thời gian (h) Loại axit
17 1 Block 1 0h axit formic 0.25M
37 2 Block 1 3h axit lactic 0.25M
9 3 Block 1 7h axit HCl 0.25M
33 4 Block 1 0h axit lactic 0.25M
57 5 Block 1 7h axit formic 0.25M + axit lactic 0.25M
5 6 Block 1 3h axit HCl 0.25M
1 7 Block 1 0h axit HCl 0.25M
13 8 Block 1 24h axit HCl 0.25M
61 9 Block 1 24h axit formic 0.25M + axit lactic 0.25M
41 10 Block 1 7h axit lactic 0.25M
25 11 Block 1 7h axit formic 0.25M
49 12 Block 1 0h axit formic 0.25M + axit lactic 0.25M 53 13 Block 1 3h axit formic 0.25M + axit lactic 0.25M
21 14 Block 1 3h axit formic 0.25M
45 15 Block 1 24h axit lactic 0.25M
29 16 Block 1 24h axit formic 0.25M
38 17 Block 2 3h axit lactic 0.25M
26 18 Block 2 7h axit formic 0.25M
22 19 Block 2 3h axit formic 0.25M
62 20 Block 2 24h axit formic 0.25M + axit lactic 0.25M
6 21 Block 2 3h axit HCl 0.25M
2 22 Block 2 0h axit HCl 0.25M
42 23 Block 2 7h axit lactic 0.25M
10 24 Block 2 7h axit HCl 0.25M
34 26 Block 2 0h axit lactic 0.25M
54 27 Block 2 3h axit formic 0.25M + axit lactic 0.25M
14 28 Block 2 24h axit HCl 0.25M
30 29 Block 2 24h axit formic 0.25M
50 30 Block 2 0h axit formic 0.25M + axit lactic 0.25M
46 31 Block 2 24h axit lactic 0.25M
18 32 Block 2 0h axit formic 0.25M
63 33 Block 3 24h axit formic 0.25M + axit lactic 0.25M
3 34 Block 3 0h axit HCl 0.25M
7 35 Block 3 3h axit HCl 0.25M
23 36 Block 3 3h axit formic 0.25M
55 37 Block 3 3h axit formic 0.25M + axit lactic 0.25M
35 38 Block 3 0h axit lactic 0.25M
15 39 Block 3 24h axit HCl 0.25M
31 40 Block 3 24h axit formic 0.25M
27 41 Block 3 7h axit formic 0.25M
59 42 Block 3 7h axit formic 0.25M + axit lactic 0.25M 51 43 Block 3 0h axit formic 0.25M + axit lactic 0.25M
19 44 Block 3 0h axit formic 0.25M
39 45 Block 3 3h axit lactic 0.25M
11 46 Block 3 7h axit HCl 0.25M
47 47 Block 3 24h axit lactic 0.25M
43 48 Block 3 7h axit lactic 0.25M