- Máy Agilent GC 7890A-FID.
- Cột HP-5 (30 m, 0.32 mm, 0.25 m film).
- Sử dụng nitrogen làm khí mang ở áp suất 8.7 psi. - Nhiệt độ buồng tiêm 250 oC.
84 - Nhiệt độ đầu dò 300 oC.
- Tỉ lệ chia dòng 1/20, thể tích tiêm 1 l.
- Chương trình nhiệt: Nhiệt độ đầu 60 oC, tăng 3 oC/phút đến 240 oC.
- Sắc ký đồ thu được dùng để xác định hàm lượng (%) các cấu phần có trong mẫu tinh dầu.
3.7.2. Phân tích GC/MSD
- Máy Agilent GC 7890A-MS 5975C.
- Cột TR-5MS (30 m, 0.25 mm, 0.25 m film). - Sử dụng helium làm khí mang ở áp suất 19.248 psi. - Nhiệt độ buồng tiêm 250 oC.
- Tỉ lệ chia dòng 1/20, thể tích tiêm 1 l.
- Chương trình nhiệt : Nhiệt độ đầu 60 oC, tăng 3 oC/phút đến 240 oC. - Ghi nhận khối phổ m/z trong khoảng 30-500, năng lượng ion hóa 70 eV.
- Sử dụng sắc ký đồ của dãy đồng đẳng n-alkan để tính toán chỉ số số học, AI (Arithmetic Index) theo Adams, kết hợp với thư viện phổ NIST 2008 của máy để nhận danh các cấu phần trong tinh dầu [29].
85
3.8 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN
Thử nghiệm tính kháng khuẩn được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi khuẩn, Khoa Vi sinh miễn dịch, Viện Pasteur TP.HCM.
Nguyên tắc
Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu được thử nghiệm bằng phương pháp khuyếch tán kiểm soát trên thạch: trải vi khuẩn với một số lượng nhất định trên mặt thạch, sao cho tiếp xúc đều. Đặt đĩa giấy đã tẩm tinh dầu sẳn lên bề mặt thạch. Tinh dầu sẽ khuyếch tán vào trong thạch và ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn tạo vòng kháng khuẩn xung quanh đĩa giấy.
Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
- Đĩa petri
- Que gòn
- Kẹp được hấp khử trùng
- Giấy lọc Whatman dày, đường kính 6 mm, được hấp khử trùng
- Đèn cồn - Pipetman - Đầu típ vàng, đầu típ xanh - Eppendof - Nồi hấp khử trùng - Tủ sấy - Tủấm 37 oC
- Dimetil sulfoxid (DMSO)
- Môi trường nuôi cấy : MHA (Mueller Hinton Agar), Sabouraud agar
- Độ đục chuẩn Mc Farland 0.5
- Các chủng vi khuẩn kiểm định bao gồm: Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Bacillus cereus, Salmonella typhi Ty2.
86
Thao tác
- Hấp khử trùng đĩa petri trong 50 phút. Sau đó để trong tủ sấy 3 giờ để đĩa khô hoàn toàn.
- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy, nấu sôi và khuấy đều. Cho môi trường vào bình thủy tinh và đem hấp khử trùng trong 50 phút.
- Cho khoảng 20 ml môi trường nuôi cấy vào mỗi đĩa petri, ủ 37 oC trong 24 giờ để kiểm tra sự vô trùng.
- Cấy các chủng vi khuẩn cần kiểm định vào mỗi đĩa petri (nồng độ vi khuẩn khoảng 108 tế bào).
- Dùng kẹp cho các khoanh giấy lọc Whatman vào lọ tinh dầu nguyên chất và tinh dầu được pha loãng trong dung môi DMSO, sau đó đặt lên mặt thạch đã cấy sẵn vi khuẩn kiểm định, mỗi đĩa petri đặt 2 - 4 đĩa giấy cách đều nhau, ủ 37 oC.
87
Phần 4
88 Các kết quả nghiên cứu cho thấy:
Lá:
- Hàm lượng tinh dầu: Thấp hơn so với các nước trên thế giới. Thời gian lưu trữ của lá hồ tiêu có ảnh hưởng đến hàm lượng. Đặc biệt với phương pháp MIHD cho hàm lượng tương đương hoặc cao hơn phương pháp CHHD nhưng thời gian ly trích ngắn hơn nhiều (14 phút so với 420 phút). Điều này cho thấy phương pháp MIHD phù hợp trong việc ly trích tinh dầu lá hồ tiêu.
- Thành phần hóa học tinh dầu: Chủ yếu là các hợp chất hidrocarbon. Các cấu phần chính không giống so với các nuớc trên thế giới.
- Hoạt tính sinh học: Kháng được hầu hết các chủng vi khuẩn gây bệnh thông thường ở người như đã khảo sát.
Quả: Lần đầu tiên tinh dầu quả hồ tiêu xanh trồng ở Đồng Nai được khảo sát.
- Hàm lượng tinh dầu: Phương pháp CHHD cho hàm lượng cao hơn hẳn phương pháp MIHD (1.3406% so với 0.5231%). Điều này cho thấy phương pháp CHHD ly trích tinh dầu triệt để hơn so với phương pháp MIHD mặc dù thời gian ly trích cao (15 phút so với 480 phút).
- Thành phần hóa học tinh dầu: Chiếm chủ yếu các hợp chất hidrocarbon monoterpen. Các cấu phần chính không giống so với các nuớc trên thế giới và các vùng khác ở Việt Nam.
- Hoạt tính sinh học: Tinh dầu quả cho kết quả kháng khuẩn cao hơn hẳn so với tinh dầu lá và kháng được hầu hết các chủng vi khuẩn gây bệnh thông thường ở người như đã khảo sát. Đặc biệt lần đầu tiên tinh dầu quả hồ tiêu thử nghiệm trên vi khuẩn
Staphylococcus epidermidis, Vibrio cholera.
Ngoài ra, kết quả nghiên cứu cũng cho thấy hàm lượng tinh dầu thay đổi theo phương pháp ly trích, bộ phận thực vật, cách xử lý nguyên liệu, độ héo nguyên liệu. Hai phương pháp ly trích cho thành phần hóa học khác nhau dẫn đến chỉ số vật lý, chỉ số hóa học và hoạt tính kháng vi khuẩn cũng khác nhau.
89
Kết quả xác định thành phần hóa học của tinh dầu bằng phương pháp GC/MSD và GC/FID theo tiêu chuẩn khóa thời gian lưu lần đầu tiên áp dụng trên tinh dầu lá và quả hồ tiêu xanh ở Việt Nam.
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy tinh dầu hồ tiêu có ứng dụng quan trọng trong y học. Do đó, cần chú ý và đầu tư hơn nữa với loại cây có giá trị này.
Kết quả nghiên cứu bước đầu đạt được nhằm góp phần định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo về các tác dụng dược lý khác của tinh dầu hồ tiêu như hoạt tính kháng nấm, kháng viêm…
Nước ta phần lớn hồ tiêu được xuất khẩu là hồ tiêu đen và hồ tiêu trắng, các mặt hàng khác như hồ tiêu xanh, tinh dầu... hầu như không có. Với những nghiên cứu rất cơ bản về tinh dầu hồ tiêu, chúng tôi không chỉ góp phần làm giàu bộ sưu tập các cây chứa tinh dầu ở Việt Nam mà còn hi vọng sẽ góp phần thúc đẩy việc sản xuất tinh dầu hồ tiêu – tạo một nguồn hàng xuất khẩu có giá trị cho nền kinh tế nước nhà.
90
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Đỗ Tất Lợi (1986), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản
Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 383-385.
2. Đỗ Tất Lợi (1985), Tinh dầu Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Chi nhánh TP.HCM, 90-91.
3. Hoàng Văn Lựu (2003), “Thành phần hóa học của tinh dầu cây Hồ tiêu
Piper nigrum L. và tinh dầu cây Trầu không Piper bette L. ở Nghệ An”,
Tạp chí Dược học, 43(11), trang 15-17.
4. Nguyễn Ngọc Thanh Tịnh, Nguyễn Công Hào, Đặng Chí Hiền, Kỷ yếu
hội nghị hóa học thành phố Hồ Chí Minh lần IV ngày 19/12/2008, 523- 527.
5. Lã Đình Mỡi, Lưu Đàm Cư, Trần Minh Hợi, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Thị Phương Thảo, Trần Huy Thái, Ninh Khắc Bản (2002), Tài nguyên Thực vật có Tinh dầu ở Việt Nam, tập II, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, 159-173.
6. Lê Ngọc Thạch (2003), Tinh dầu, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, TP. Hồ Chí Minh, 18, 47, 80-103, 122-130, 137-142, 389.
7. Nguyễn Thanh Huệ, Trịnh Minh Khang, Nguyễn Tấn Hoàng Sơn, Nguyễn
Thị Bích Tuyền (2012), “ Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu gừng (Zingiber officinale Roscoe) và tinh dầu tiêu (Piper nigrum L.)”, Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, 21a, 139-143.
8. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam quyển 1, Nhà xuất bản Trẻ, TP.
Hồ Chí Minh, 292.
9. Phạm Thị Hòa, Đào Lê Minh Tuấn (1997), “Góp phần nghiên cứu cây Hồ
Tiêu”, Tạp chí Dược liệu, 2( 3), 12-14.
10.Phan Nhật Minh, Mai Thành Chí, Phùng Văn Trung, Bùi Trọng Đạt,
91
tiêu (Piper nigrum L.) chiết xuất bằng phương pháp carbon dioxid lỏng siêu tới hạn”, Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, 6, 97-101. 11.Tôn Nữ Tuấn Nam, Trần Kim Loang, Đào Thị Lan Hoa (2008), Kỹ thuật
trồng, thâm canh, chế biến và bảo quản Hồ Tiêu, Bộ Nông nghiệp và PTNT, Hà Nội, 70-73.
12.Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y Học, TP. Hồ Chí Minh, 1210.
Tiếng Anh
13.A. P. Martins, L. Salgueiro, R. Vila, F. Tomi, S. Canigueral, J. Casanova, A. Proença da Cunha, T. Adzet (1998), “Essential oils from four Piper
species”. Phytochemistry, 49(7), 2019-2023.
14.Brian M. Lawrence (1981), Major Tropical Spices-Pepper (Piper nigrum L.), Essential Oil 1979-1980, Allured Publishing, Wheaton, 140- 143, 149-155, 196-199, 216.
15.B. Wannissorn, S. Jarikasem, T. Siriwangchai, S. Thubthimthed (2005), “Antibacterial properties of essential oil from Thai medicinal plants”,
Fitoterapia, 233-236.
16.C. Bandopadhyay, P. S. Variyar (1988), On the volatiles of pepper plant
(Piper nigrum L.), PAFAI J., 10(1), 25-27, 29.
17.C. Perakis, V. Louli, K. Magoulas (2005), “Supercritical fluid extraction of black pepper oil”, Journal of Food Engineering, 71, 386-393.
18.E. Gildemeister, F. Hoffmann (1929), Die Atherischen Ole, 3rd, Verlag Von Schimmel, Leipzig, 2, 457-458.
19.Ernest Guenther (1952), The Essential Oils, D. Van Nostrand, New York, Vol. V, 135-144.
20.E. R. Jansz, S. Balachandran, E. V. Packiyasothy, S. Ratnayake (1984), “Effect of maturity on some chemical constituents of Sri Lankan pepper (Piper nigrum L.)”, Journal of the Science of Food and Agriculture,
92
21.F. Tchoumbougnang, D. P. M. Jazet, M. L. Sameza, N. Fombotioh, W. N. A. Vyry, A. Z. P. Henri, C. Menut (2009), “Comparative essential oils composition and insecticidal effect of different tissues of Piper capense
L., Piperguineense Schum. et Thonn., Piper nigrum L. and Piper umbellatum L. grown in Cameroon”, African Journal of Biotechnology,
8(3), 424-431.
22.Giorga Purcaro, Peter Q. Tranchida, Rosângela Assis Jacques, Elina Bastos Caramão, Sabrina Moret, Lanfranco Conte, Paola Dugo, Giovanni Dugo, Luigi Mondello (2009), Characterization of the yerba mate (Ilex paraguariensis) volatile fraction using solidphase microextraction- comprehensive 2-D GC-MS, Journal of Separation Science, 32(21), 3755- 3763.
23.G. Raju, M. Maridass (2011), Evaluation of antimicrobial Potential of
Piper (L.) species, Nature of Pharmaceutical Technology, 1(1), 19-20.
24.İbrahim Tümen, Markku Reunanen (2010), A comparative study on
Turpentine oils of oleoresins of Pinus sylvestris L. from three districts of Denizli, Records of Natural Product, 4(4), 224-229.
25.I. Sasidharan, A. N. Menon (2010), Comparative chemical composition
and antimicrobial activity of berry and leaf essential oils of Piper nigrum
L, International Journal of Biological and Medical Research, 1(4), 215- 218.
26.J. Pino, G. Rodriguez-Feo, P. Borges, A. Rosado (1990), Chemical and sensory properties of black pepper oil (Piper nigrum L.), Nahrung,
34, 555-560.
27.M. A. Sumathykutty, J. M. Rao, K. P. Padmakumari, C. S. Narayanan (1999), “Essential oil constituents of some Piper species”, Flavour and Fragrance Journal, 14, 279-282.
28.M. McCarron, A. Mills, D. Whittaker, T. Kurian, J. Verghese (1995), Comparison between green and black pepper oils from Piper nigrum L.
93
Berries of Indian and Sri Lankan origin, Flavour and Fragrance Journal
10, 47-50.
29.M. Rouatbi, A. Duquenoy, P. Giampaoli (2007), “Extraction of the essential oil of thyme and black pepper by superheated steam”, Journal of Food Engineering, 78, 708–714.
30.Robert P. Adams (2007), Identification of Essential Oil Components by Gas Chromatography/Mass Spectrometry, 4th Edition, Allured Publishing, Carol Stream, 6, 10-29.
31.T. Hasselstrom, E. J. Hewitt, K. S. Konigsbacher, J. J. Ritter (1951), Composition of volatile oil of black pepper, Archives of Industrial Hygiene and Occupational Medicine, 4(199-122), 114.
32.U. Topal, M. Sasaki, M. Goto, S. Otles (2008), “Chemical compositions and antioxidant properties of essential oils from nine species of Turkish plants obtained by supercritical carbon dioxide extraction and steam distillation”, International Journal of Food Sciences and Nutrition, 59(7- 8), 619-634. Website 33.http://vi.wikipedia.org/wiki/H%E1%BB%93_ti%C3%AAu 34.http://www.duoclieu.org/2012/02/ho-tieu-piper-nigrum-l-ho-ho-tieu.html 35.http://plants.usda.gov/java/nameSearch 36.http://www.theepicentre.com/Spices/pepper.html 37.http://www.uni-graz.at/~katzer/engl/Pipe_nig.html#const 38.http://en.wikipedia.org/wiki/Black_pepper 39.http://product.tinhdau.vn/Pure-essential-oil/2012-05/58.oms