Thời gian lưu trữ - Khảo sát tinh dầu hồ tiêu (pi- 123docz.net

Cân 10 mẫu lá hồ tiêu, mỗi mẫu 200 g. Trải riêng từng mẫu ra rổ chứa khác nhau, để nơi thoáng mát, đánh số thời gian lưu trữ từng mẫu theo dự định. Cân khối

lượng mẫu sau thời gian lưu trữ, ghi nhận khối lượng và tiến hành chưng cất hơi nước cổ điển trong cùng thời gian 7 giờ, xác định khối lượng tinh dầu thu được, quan sát màu sắc và mùi vị. Thực hiện thí nghiệm 3 lần. Xử lý thống kê, thu được kết quả trung bình. Kết quả ghi trong phần nghiên cứu.

3.3.2 Xử lý nguyên liệu

Cân 2 mẫu nguyên liệu, mỗi mẫu 200 g (mẫu không xay và mẫu xay nhuyễn). Tiến hành chưng cất hơi nước cho từng mẫu riêng biệt trong những khoảng thời gian nhất định. Ghi nhận khối lượng và hiệu suất tinh dầu theo thời gian của mỗi mẫu. Kết quả ghi trong phần nghiên cứu.

3.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH

Một số thiết bị trong ly trích tinh dầu

- Bộ chưng cất Clevenger.

- Lò vi sóng gia dụng SANYO EM - D9553N cải tiến - Máy cô quay HEIDOLPH.

Hình 3.3. Lò vi sóng gia dụng cải tiến

3.4.1 Phương pháp CHHD

- Nguyên liệu 200 g lá hồ tiêu – 200 g quả hồ tiêu.

- Xay nhỏ, cho vào bình cầu 2000 ml, thêm 1000 ml nước.

- Ráp hệ thống chưng cất, tiến hành chưng cất tinh dầu theo thời gian nhất định để xác định thời gian ly trích tối ưu.

- Để nguội, trích lấy tinh dầu trong ống gạn bằng dietil eter. - Làm khan dịch trích bằng Na2SO4 khan.

- Thu hồi dung môi dưới áp suất kém.

- Cân chính xác lượng tinh dầu ly trích được.

- Tiến hành vẽ đồ thị biểu diễn khối lượng theo thời gian ly trích, từ đó xác định được thời điểm tối ưu và khối lượng tinh dầu cao nhất có thể thu được. Khối lượng tinh dầu này chia cho khối lượng nguyên liệu sử dụng tương ứng, kết quả này có thể xem như đó là hàm lượng tinh dầu tối đa (theo phương pháp ly trích) một cách tương đối.

3.4.2 Phương pháp MIHD

- Nguyên liệu 200 g lá hồ tiêu – 200 g quả hồ tiêu.

- Xay nhỏ, cho vào bình cầu 2000 ml, thêm 1000 ml nước.

- Ráp hệ thống chưng cất, chiếu xạ vi sóng ở công suất 750 W theo thời gian nhất định để xác định thời gian ly trích tối ưu.

- Để nguội, trích lấy tinh dầu trong ống gạn bằng dietil eter. - Làm khan dung dịch ly trích bằng Na2SO4 khan.

- Thu hồi dung môi dưới áp suất kém.

- Cân chính xác lượng tinh dầu ly trích được.

phương pháp ly trích) một cách tương đối.

3.5 CÁC CHỈ SỐ VẬT LÝ

3.5.1 Tỷ trọng

3.5.1.1 Lý thuyết

Tỷ trọng của tinh dầu dao động từ (0.7 – 1.2). Hầu hết các tinh dầu đều có tỷ trọng nhỏ hơn nước, trừ một vài tinh dầu như tinh dầu hương nhu, long não, quế...

Tỷ trọng của tinh dầu thường phụ thuộc vào thành phần hóa học của tinh dầu. Những tinh dầu có chứa nhiều hợp chất hidrocarbon thường có tỷ trọng nhỏ hơn 0.9. Những tinh dầu có chứa nhiều hợp chất oxigen, hợp chất hương phương thường có tỷ trọng lớn hơn 1.

Tỷ trọng, tỷ trọng tương đối, của tinh dầu tại 20 oC, , là tỉ số khối lượng tinh dầu ở 20 oC trên khối lượng của cùng một thể tích nước cất cũng ở 20 oC.

Ở 20 oC, nước có tỷ trọng 0.99823 g/ml. Công thức tính tỷ trọng:

76 Với:

m0: khối lượng tỷ trọng kế rỗng và bi thủy tinh (g). m1: khối lượng tỷ trọng kế, bi thủy tinh và nước cất (g). m2: khối lượng tỷ trọng kế, bi thủy tinh và tinh dầu (g).

3.5.1.2 Thực hành Dụng cụ - Tỷ trọng kế. - Cân phân tích có độ chính xác tới 0.0001 g. - Nhiệt kế chia vạch 0.2 oC. - Bể điều nhiệt Thao tác

- Đầu tiên tỷ trọng kế và bi thủy tinh phải được rửa sạch, tráng lại bằng aceton, để khô tự nhiên.

- Cho bi thủy tinh vào tỷ trọng kế. Cân tỉ trọng kế rỗng và bi thủy tinh (mo). - Cho nước cất vào đầy tới cổ bình, đậy nút, lau khô phần nước trào. Cân khối lượng cả bình, bi thủy tinh và nước cất (m1).

- Thay nước cất bằng tinh dầu cũng theo các cách thức như trên. Cân khối lượng cả bình và tinh dầu (m2)

- Lưu ý: Tất cả các công việc nói trên đều phải thực hiện ở cùng một nhiệt độ là 31 oC.

- Sai lệch giữa hai lần xác định liên tiếp không quá 0.001 g. Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của hai lần xác định liên tiếp.

Bảng 3.1. Tỉ trọng của tinh dầu hồ tiêu Bộ phận Phương pháp ly trích Lần đo m0 m1 m2 31 31 d 1 25.5335 29.8912 29.3386 2 25.5334 29.8911 29.3385 CHHD 3 25.5335 29.8912 29.3386 0.8732 1 25.5335 29.8920 29.3938 2 25.5335 29.8921 29.3939 LÁ MIHD 3 25.5336 29.8920 29.3938 0.8857 1 25.5334 29.8915 29.2321 2 25.5334 29.8914 29.2320 CHHD 3 25.5335 29.8915 29.2321 0.8487 1 25.5334 29.8955 29.2508 2 25.5335 29.8954 29.2507 QỦA MIHD 3 25.5335 29.8955 29.2508 0.8522 3.5.2 Chỉ số khúc xạ 3.5.2.1 Lý thuyết

Chỉ số khúc xạ còn gọi là chiết suất, là tỉ số giữa sin góc tới và sin góc khúc xạ của một tia sáng có độ dài sóng xác định đi từ không khí qua tinh dầu ở nhiệt độ xác định.

Người ta thường dùng ánh sáng của đèn natrium (D) có độ dài sóng 589,9 ± 0,3

nm. Nhiệt độ tham chiếu là 20 oC (trừ trường hợp tinh dầu không thể ở thể lỏng tại nhiệt độ này thì phải chọn 25 hoặc 30 oC.

Chỉ số khúc xạ, được tính theo công thức:

Với:

: chỉ số khúc xạ ở nhiệt độ qui định t = 20 oC : chỉ số khúc xạ đo ở nhiệt độ

3.5.2.2 Thực hành Dụng cụ

Sử dụng khúc xạ kế Shanghai Physico–Optical Instrument factory WYA-S ABBE REFRACTOMETER

Hình 3.5. Khúc xạ kế

Thao tác

- Rửa sạch nơi chứa mẫu bằng aceton. Sau đó cho tinh dầu hồ tiêu lên nơi chứa mẫu.

- Bật công tắc và kéo ngọn đèn gần với nơi chứa mẫu.

- Chỉnh nút để thấy rõ được hai vùng sáng tối trong mẫu. Ranh giới giữa hai vùng cũng là đường cắt ngang của hình chéo.

- Bấm nút “Read” để đọc chỉ số khúc xạ. Bấm nút “Tempt” để xem nhiệt độ.

Bảng 3.2. Chỉ số khúc xạ của tinh dầu hồ tiêu Bộ phận Phương pháp ly trích Lần đo 33' D n n 33D 1 1.4772 2 1.4761 CHHD 3 1.4779 1.4824 1 1.4745 2 1.4776 LÁ MIHD 3 1.4755 1.4810 1 1.4716 2 1.4712 CHHD 3 1.4732 1.4770 1 1.4825 2 1.4837 QUẢ MIHD 3 1.4871 1.4898

3.5.3 Góc quay cực

3.5.3.1 Lý thuyết

Hầu hết tinh dầu đều có tính quang hoạt, nghĩa là có khả năng làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực khi ánh sáng này đi xuyên qua. Khả năng làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực của mỗi tinh dầu hầu như đều khác nhau và biểu thị bằng góc quay cực.

Góc quay cực của tinh dầu (kí hiệu ), được tính bằng độ, là góc quay mặt phẳng ánh sáng phân cực của ánh sáng có độ dài sóng là 589,3 ± 0.3 nm, khi ánh

sáng này được truyền ngang qua một ống chứa tinh dầu dài 0,5 dm trong những điều

kiện nhất định.

Những tinh dầu làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực theo chiều kim đồng

hồ gọi là tinh dầu hữu triền (+, d) và ngược lại gọi là tinh dầu tả triền (-, d).

Để xác định góc quay cực người ta thường dùng các loại triền quang kế dùng

đèn natrium hoặc kính lọc màu vàng da cam, điều chỉnh bằng tay hay tự động hiện

số.

Góc quay cực của phần lớn các loại tinh dầu rất ít thay đổi theo nhiệt độ, do đó có thể xác định ở nhiệt độ phòng.

3.5.3.2 Thực hành

Dụng cụ

- Triền quang kế WXX – 2 AUTOMATIC POLARIMETER.

Thao tác

Đo góc quay cực của tinh dầu tiêu ở nhiệt độ t = 22 oC và λ = 589 nm bằng triền quang kế.

- Bật nguồn sáng cho đến khi đạt được cường độ sáng.

- Cho tinh dầu vào đầy ống thử và đậy nắp lại. Cần phải chú ý không để lẫn bọt không khí vào ống.

- Đặt ống vào triền quang kế, đọc góc quay quan sát và ghi nhận chiều quay. - Chú ý: phải hiệu chỉnh trước triền quang kế về 0 với ống không chứa tinh dầu.

Bảng 3.3. Góc quay cực của tinh dầu hồ tiêu

Bộ phận Phương pháp ly trích Lần đo Góc quay cực α22D

1 +1o314’ 2 +1o316’ CHHD 3 +1o315’ +2o630’ 1 +1o423’ 2 +1o426’ LÁ MIHD 3 +1o425’ +2o849’ 1 -0o325’ 2 -0o328’ CHHD 3 -0o322’ -0o649’ 1 -3o589’ 2 -3o586’ QUẢ MIHD 3 -3o043’ -7o172’ Hình 3.6. Triền quang kế

3.6 CHỈ SỐ HÓA HỌC 3.6.1 Chỉ số acid

Chỉ số acid (AI) là số mg hidroxid kalium cần thiết để trung hòa các acid tự do có trong 1 g tinh dầu.

Cùng một loại tinh dầu chỉ số acid thay đổi tùy thuộc vào phương pháp khai thác và thời gian tồn trữ. Trong các tinh dầu tồn trữ lâu hợp chất ester bị thủy giải hoặc các hợp chất aldehid bị oxid hóa nên chỉ số acid thường cao hơn các tinh dầu mới sản xuất

KOH trung hòa acid tự do trong tinh dầu theo phản ứng: RCOOH + KOH → RCOOK + H2O

Từ lượng KOH và khối lượng mẫu tinh dầu đã sử dụng, suy ra chỉ số acid theo công thức: KOH KOH td C V m AI 56.1  

mtd : khối lượng tinh dầu (g)

VKOH : thể tích dung dịch KOH (ml)

CKOH : Nồng độ dung dịch KOH

Dụng cụ và hóa chất

- Bình cầu hoặc erlen 100 ml - Microburet 5 ml ± 0.01 ml - Phenolptalein (0.2 g/l etanol) - KOH 0.1 N (pha trong etanol 95%) - Etanol 95%

Thao tác

- Cân khoảng 0.2 g tinh dầu cho vào erlen 100 ml.

- Thêm 5 ml etanol, 1 giọt phenolptalein. Lắc đều. Chuẩn độ bằng KOH 0.1N. - Thực hiện 3 lần, lấy kết quả trung bình.

Bảng 3.4. Chỉ số acid của tinh dầu hồ tiêu

Bộ phận Phương pháp ly trích Lần đo m (g) V (ml) AI 1 0.2030 0.14 2 0.2007 0.13 CHHD 3 0.2060 0.14 3.75 1 0.2028 0.13 2 0.2022 0.12 LÁ MIHD 3 0.2026 0.12 3.46 1 0.2008 0.03 2 0.2024 0.02 CHHD 3 0.2065 0.04 0.83 1 0.2042 0.04 2 0.2034 0.04 QUẢ MIHD 3 0.2056 0.04 1.06 3.6.2 Chỉ số savon hóa

Chỉ số savon hóa được tính bằng công thức:

 HCl HCl td C V V m SI 56.1  0  

V0 : thể tích dung dịch acid HCl dùng cho mẫu trắng (ml) VHCl : thể tích dung dịch acid HCl dùng cho mẫu tinh dầu (ml) mtd : khối lượng mẫu tinh dầu (g)

CHCl : Nồng độ dung dịch HCl

Dụng cụ và hóa chất

Bình cầu 100 - 250 ml cổ nhám chịu được kiềm, có trang bị ống hoàn lưu nước

Burette 20 ml ± 0.1 ml HCl 0.1 N

KOH 0.1 N (pha trong etanol 95%) Phenolptalein (2 g/l etanol)

Thao tác

Cân khoảng 0.2 g tinh dầu cho vào bình phản ứng. Thêm 20 ml dung dịch KOH 0.1 N và vài viên đá bọt. Lắp ống hoàn lưu vào và đun cách thủy trong 1 giờ 30 phút. Để nguội, tháo ống hoàn lưu ra, cho thêm vào 20 ml nước và 1 giọt phenolptalein.

Chuẩn độ hỗn hợp phản ứng bằng HCl 0.1 N.

Thực hiện tương tự như trên với mẫu trắng (nước cất).

Bảng 3.5. Chỉ số savon hóa của tinh dầu hồ tiêu

Bộ phận Phương pháp ly trích Lần đo mtd (g) V0 (ml) VHCl (ml) SI 1 0.2021 20 19.44 2 0.2032 20 19.44 CHHD 3 0.2060 20 19.43 15.55 1 0.2013 20 19.44 2 0.2002 20 19.44 LÁ MIHD 3 0.2026 20 19.44 15.64 1 0.2028 20 19.70 2 0.2014 20 19.70 CHHD 3 0.2006 20 19.70 8.43 1 0.2024 20 19.02 2 0.2014 20 19.03 QUẢ MIHD 3 0.2056 20 19.01 27.07 3.6.3 Chỉ số ester

Dựa vào chỉ số acid và chỉ số savon hóa đã xác định ở trên, ta suy ra chỉ số ester theo công thức: EI = SI – AI

3.7 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TINH DẦU

Mẫu tinh dầu được phân tích bằng thiết bị sắc ký khí đầu dò ion hóa ngọn lửa (GC/FID) và sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MSD).

3.7.1. Phân tích GC/FID

- Máy Agilent GC 7890A-FID.

- Cột HP-5 (30 m, 0.32 mm, 0.25 m film).

- Sử dụng nitrogen làm khí mang ở áp suất 8.7 psi. - Nhiệt độ buồng tiêm 250 oC.

84 - Nhiệt độ đầu dò 300 oC.

- Tỉ lệ chia dòng 1/20, thể tích tiêm 1 l.

- Chương trình nhiệt: Nhiệt độ đầu 60 oC, tăng 3 oC/phút đến 240 oC.

- Sắc ký đồ thu được dùng để xác định hàm lượng (%) các cấu phần có trong mẫu tinh dầu.

3.7.2. Phân tích GC/MSD

- Máy Agilent GC 7890A-MS 5975C.

- Cột TR-5MS (30 m, 0.25 mm, 0.25 m film). - Sử dụng helium làm khí mang ở áp suất 19.248 psi. - Nhiệt độ buồng tiêm 250 oC.

- Tỉ lệ chia dòng 1/20, thể tích tiêm 1 l.

- Chương trình nhiệt : Nhiệt độ đầu 60 oC, tăng 3 oC/phút đến 240 oC. - Ghi nhận khối phổ m/z trong khoảng 30-500, năng lượng ion hóa 70 eV.

- Sử dụng sắc ký đồ của dãy đồng đẳng n-alkan để tính toán chỉ số số học, AI (Arithmetic Index) theo Adams, kết hợp với thư viện phổ NIST 2008 của máy để nhận danh các cấu phần trong tinh dầu [29].

3.8 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

Thử nghiệm tính kháng khuẩn được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi khuẩn, Khoa Vi sinh miễn dịch, Viện Pasteur TP.HCM.

Nguyên tắc

Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu được thử nghiệm bằng phương pháp khuyếch tán kiểm soát trên thạch: trải vi khuẩn với một số lượng nhất định trên mặt thạch, sao cho tiếp xúc đều. Đặt đĩa giấy đã tẩm tinh dầu sẳn lên bề mặt thạch. Tinh dầu sẽ khuyếch tán vào trong thạch và ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn tạo vòng kháng khuẩn xung quanh đĩa giấy.

Dụng cụ, thiết bị và hóa chất

- Đĩa petri

- Que gòn

- Kẹp được hấp khử trùng

- Giấy lọc Whatman dày, đường kính 6 mm, được hấp khử trùng

- Đèn cồn - Pipetman - Đầu típ vàng, đầu típ xanh - Eppendof - Nồi hấp khử trùng - Tủ sấy - Tủấm 37 oC

- Dimetil sulfoxid (DMSO)

- Môi trường nuôi cấy : MHA (Mueller Hinton Agar), Sabouraud agar

- Độ đục chuẩn Mc Farland 0.5

- Các chủng vi khuẩn kiểm định bao gồm: Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Bacillus cereus, Salmonella typhi Ty2.

Thao tác

- Hấp khử trùng đĩa petri trong 50 phút. Sau đó để trong tủ sấy 3 giờ để đĩa khô hoàn toàn.

- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy, nấu sôi và khuấy đều. Cho môi trường vào bình thủy tinh và đem hấp khử trùng trong 50 phút.

- Cho khoảng 20 ml môi trường nuôi cấy vào mỗi đĩa petri, ủ 37 oC trong 24 giờ để kiểm tra sự vô trùng.

- Cấy các chủng vi khuẩn cần kiểm định vào mỗi đĩa petri (nồng độ vi khuẩn khoảng 108 tế bào).

- Dùng kẹp cho các khoanh giấy lọc Whatman vào lọ tinh dầu nguyên chất và tinh dầu được pha loãng trong dung môi DMSO, sau đó đặt lên mặt thạch đã cấy sẵn vi khuẩn kiểm định, mỗi đĩa petri đặt 2 - 4 đĩa giấy cách đều nhau, ủ 37 oC.

Phần 4

88 Các kết quả nghiên cứu cho thấy:

 Lá:

- Hàm lượng tinh dầu: Thấp hơn so với các nước trên thế giới. Thời gian lưu