THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN - Khảo sát tinh d- 123docz.net

Phương pháp thử nghiệm: phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và đo đường kính vòng ức chế. Vật liệu thử nghiệm là đĩa giấy có đường kính 6 mm. Dung môi pha loãng tinh dầu là DMSO.

Hoạt tính kháng khuẩn được thử nghiệm trên:

- 03 vi khuẩn gram (+): Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus,

- 04 vi khuẩn gram (-): Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi Ty2 , Vibrio cholera.

Tinh dầu thử nghiệm bao gồm tinh dầu nguyên chất và tinh dầu pha loãng theo thứ tự: G0: Tinh dầu nguyên chất. G1: Tinh dầu pha loãng 10 lần. G2: Tinh dầu pha loãng 100 lần. G3: Tinh dầu pha loãng 1000 lần. G4: Tinh dầu pha loãng 10000 lần.

Đường kính vòng vô khuẩn = 6 mm: không xuất hiện vòng vô khuẩn. Đường kính vòng vô khuẩn > 30 mm: không có sự phát triển của vi khuẩn.

2.8.1. Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá hồ tiêu

Bảng 2.31. Kết quả kháng khuẩn của tinh dầu lá hồ tiêu

Đường kính vòng vô khuẩn (mm)

Phương pháp CHHD Phương pháp MIHD

Vi khuẩn G0 G1 G2 G3 G0 G1 G2 G3 G4 Vi khuẩn gram (+) Staphylococcus epidermidis 6 6 6 6 17 6 6 6 6 Staphylococcus aureus 10 8 6 6 15 10 7 6 6 Bacillus cereus 10 8 7 6 14 12 9 8 8 Vi khuẩn gram (-) Escherichia coli 6 6 6 6 13 8 7 7 7 Pseudomonas aeruginosa 6 6 6 6 10 7 7 7 7

Salmonella typhi Ty2 6 6 6 6 10 6 6 6 6

Vibrio cholera 10 6 6 6 15 9 8 8 8

Phương pháp đun nóng cổ điển: Ở nồng độ tinh dầu nguyên chất G0, thấy xuất hiện vòng vô khuẩn trên các chủng Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Bacillus cereus. Ở nồng độ G1, thấy xuất hiện vòng vô khuẩn trên chủng

Staphylococcus aureus, Bacillus cereus. Ở nồng độ G2, thấy xuất hiện vòng vô khuẩn trên chủng Bacillus cereus. Ở nồng độ G3, G4 không thấy xuất hiện vòng vô khuẩn trên các chủng thử nghiệm.

Phương pháp chiếu xạ vi sóng: Ở nồng độ tinh dầu nguyên chất G0, thấy xuất hiện vòng vô khuẩn trên tất cả các chủng thử nghiệm. Ở nồng độ G1, G2 thấy xuất hiện vòng vô khuẩn trên chủng Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Bacillus cereus. Ở nồng độ G3, G4 thấy xuất hiện vòng vô khuẩn trên chủng Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Bacillus cereus.

Tinh dầu lá hồ tiêu thu được từ phương pháp vi sóng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn.

2.8.2. Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu quả hồ tiêu

Bảng 2.32. Kết quả kháng khuẩn của tinh dầu quả hồ tiêu

Đường kính vòng vô khuẩn (mm)

Phương pháp CHHD Phương pháp MIHD

Vi khuẩn G0 G1 G2 G0 G1 G2 G3 G4 Vi khuẩn gram (+) Staphylococcus epidermidis 17 6 6 23 14 6 6 6 Staphylococcus aureus 16 8 6 35 24 11 6 6 Bacillus cereus 12 8 6 22 17 10 7 7 Vi khuẩn gram (-) Escherichia coli 20 15 6 35 25 6 6 6 Pseudomonas aeruginosa 8 6 6 15 7 6 6 6

Salmonella typhi Ty2 17 6 6 30 21 6 6 6

Vibrio cholera 17 10 6 27 20 12 6 6

Phương pháp đun nóng cổ điển: Ở nồng độ tinh dầu nguyên chất G0, thấy xuất hiện vòng vô khuẩn trên tất cả các chủng thử nghiệm.Ở nồng độ G1, thấy xuất hiện vòng vô khuẩn trên chủng Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Bacillus cereus. Ở nồng độ G2, G3, G4 không thấy xuất hiện vòng vô khuẩn trên các chủng thử nghiệm.

Phương pháp chiếu xạ vi sóng: Ở nồng độ tinh dầu nguyên chất G0 và G1, thấy xuất hiện vòng vô khuẩn trên tất cả các chủng thử nghiệm. Ở nồng độ G2, thấy xuất hiện vòng vô khuẩn trên chủng Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Bacillus cereus. Ở nồng độ G3, G4 chỉ xuất hiện vòng vô khuẩn trên chủng Bacillus cereus.

Từ các kết quả thực nghiệm cho thấy mẫu tinh dầu vi sóng có khả năng kháng khuẩn mạnh so với mẫu tinh dầu cổ điển.

2.8.3. So sánh hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu hồ tiêu

Bảng 2.33. So sánh đường kính vòng vô khuẩn của tinh dầu nguyên chất

Đường kính vòng vô khuẩn (mm)

Phương pháp CHHD Phương pháp MIHD

Vi khuẩn LÁ QUẢ LÁ QUẢ Vi khuẩn gram (+) Staphylococcus epidermidis 6 17 17 23 Staphylococcus aureus 10 16 15 35 Bacillus cereus 10 12 14 22 Vi khuẩn gram (-) Escherichia coli 6 20 13 35 Pseudomonas aeruginosa 6 8 10 15 Salmonella typhi Ty 2 6 17 10 30 Vibrio cholera 10 17 15 27

Tinh dầu hồ tiêu thu được từ phương pháp MIHD có hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn tinh dầu hồ tiêu thu được từ phương pháp CHHD trên tất cả các chủng thử nghiệm. Điều này có thể giải thích là do sự khác nhau về thành phần hóa học của tinh dầu được ly trích từ hai phương pháp.

Bảng 2.34. So sánh hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu quả hồ tiêu của luận văn với tài liệu tham khảo (phương pháp CHHD)

Vi khuẩn Luận văn [15] [23] Vi khuẩn gram (+) Staphylococcus epidermidis 17 - - Staphylococcus aureus 16 16 11 Bacillus cereus 12 10 - Vi khuẩn gram (-) Escherichia coli 20 6 15 Pseudomonas aeruginosa 8 6 - Salmonella typhi Ty 2 17 - 11 Vibrio cholera 17 - - -: Không thử nghiệm

Nhìn chung, tinh dầu quả hồ tiêu của luận văn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn so với tài liệu tham khảo trên các chủng Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella typhi Ty 2.

Phần 3

3.1 NGUYÊN LIỆU

Bộ phận sử dụng gồm lá và quả hồ tiêu. Nguyên liệu được sử dụng ngay sau khi thu hái và xử lý. Thời gian thu hái vào tháng 9 năm 2009 tại ấp 3, xã Hiếu Liêm, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai (đây là vùng có diện tích trồng hồ tiêu rộng lớn).

3.2 GIẢI PHẪU HỌC

Xác định hình dạng cơ quan chứa tinh dầu lá và quả hồ tiêu được thực hiện tại Bộ môn Thực vật, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên.

3.2.1 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất

- Chén sứ nhỏ - Kim mũi giác - Dao lam - Gôm - Lame - Lamelle - Bán cầu lỗ - Kính hiển vi Motic có độ phóng đại × 40, × 100, × 400. - Nước Javel - Nước cất 3.2.2 Thực hành

- Cắt mẫu cho vào chén sứ chứa Javel để loại nội dung tế bào.

- Dùng nước cất rửa sạch Javel cho đến khi không còn ngửi thấy mùi.

- Cho một giọt nước cất và 1 mẫu lên lame, đậy lamelle lại sao cho không có bọt khí, quan sát dưới kính hiển vi ở các vật kính.

3.3 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG

3.3.1 Thời gian lưu trữ

Cân 10 mẫu lá hồ tiêu, mỗi mẫu 200 g. Trải riêng từng mẫu ra rổ chứa khác nhau, để nơi thoáng mát, đánh số thời gian lưu trữ từng mẫu theo dự định. Cân khối

lượng mẫu sau thời gian lưu trữ, ghi nhận khối lượng và tiến hành chưng cất hơi nước cổ điển trong cùng thời gian 7 giờ, xác định khối lượng tinh dầu thu được, quan sát màu sắc và mùi vị. Thực hiện thí nghiệm 3 lần. Xử lý thống kê, thu được kết quả trung bình. Kết quả ghi trong phần nghiên cứu.

3.3.2 Xử lý nguyên liệu

Cân 2 mẫu nguyên liệu, mỗi mẫu 200 g (mẫu không xay và mẫu xay nhuyễn). Tiến hành chưng cất hơi nước cho từng mẫu riêng biệt trong những khoảng thời gian nhất định. Ghi nhận khối lượng và hiệu suất tinh dầu theo thời gian của mỗi mẫu. Kết quả ghi trong phần nghiên cứu.

3.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH

Một số thiết bị trong ly trích tinh dầu

- Bộ chưng cất Clevenger.

- Lò vi sóng gia dụng SANYO EM - D9553N cải tiến - Máy cô quay HEIDOLPH.

Hình 3.3. Lò vi sóng gia dụng cải tiến

3.4.1 Phương pháp CHHD

- Nguyên liệu 200 g lá hồ tiêu – 200 g quả hồ tiêu.

- Xay nhỏ, cho vào bình cầu 2000 ml, thêm 1000 ml nước.

- Ráp hệ thống chưng cất, tiến hành chưng cất tinh dầu theo thời gian nhất định để xác định thời gian ly trích tối ưu.

- Để nguội, trích lấy tinh dầu trong ống gạn bằng dietil eter. - Làm khan dịch trích bằng Na2SO4 khan.

- Thu hồi dung môi dưới áp suất kém.

- Cân chính xác lượng tinh dầu ly trích được.

- Tiến hành vẽ đồ thị biểu diễn khối lượng theo thời gian ly trích, từ đó xác định được thời điểm tối ưu và khối lượng tinh dầu cao nhất có thể thu được. Khối lượng tinh dầu này chia cho khối lượng nguyên liệu sử dụng tương ứng, kết quả này có thể xem như đó là hàm lượng tinh dầu tối đa (theo phương pháp ly trích) một cách tương đối.

3.4.2 Phương pháp MIHD

- Nguyên liệu 200 g lá hồ tiêu – 200 g quả hồ tiêu.

- Xay nhỏ, cho vào bình cầu 2000 ml, thêm 1000 ml nước.

- Ráp hệ thống chưng cất, chiếu xạ vi sóng ở công suất 750 W theo thời gian nhất định để xác định thời gian ly trích tối ưu.

- Để nguội, trích lấy tinh dầu trong ống gạn bằng dietil eter. - Làm khan dung dịch ly trích bằng Na2SO4 khan.

- Thu hồi dung môi dưới áp suất kém.

- Cân chính xác lượng tinh dầu ly trích được.

phương pháp ly trích) một cách tương đối.

3.5 CÁC CHỈ SỐ VẬT LÝ

3.5.1 Tỷ trọng

3.5.1.1 Lý thuyết

Tỷ trọng của tinh dầu dao động từ (0.7 – 1.2). Hầu hết các tinh dầu đều có tỷ trọng nhỏ hơn nước, trừ một vài tinh dầu như tinh dầu hương nhu, long não, quế...

Tỷ trọng của tinh dầu thường phụ thuộc vào thành phần hóa học của tinh dầu. Những tinh dầu có chứa nhiều hợp chất hidrocarbon thường có tỷ trọng nhỏ hơn 0.9. Những tinh dầu có chứa nhiều hợp chất oxigen, hợp chất hương phương thường có tỷ trọng lớn hơn 1.

Tỷ trọng, tỷ trọng tương đối, của tinh dầu tại 20 oC, , là tỉ số khối lượng tinh dầu ở 20 oC trên khối lượng của cùng một thể tích nước cất cũng ở 20 oC.

Ở 20 oC, nước có tỷ trọng 0.99823 g/ml. Công thức tính tỷ trọng:

76 Với:

m0: khối lượng tỷ trọng kế rỗng và bi thủy tinh (g). m1: khối lượng tỷ trọng kế, bi thủy tinh và nước cất (g). m2: khối lượng tỷ trọng kế, bi thủy tinh và tinh dầu (g).

3.5.1.2 Thực hành Dụng cụ - Tỷ trọng kế. - Cân phân tích có độ chính xác tới 0.0001 g. - Nhiệt kế chia vạch 0.2 oC. - Bể điều nhiệt Thao tác

- Đầu tiên tỷ trọng kế và bi thủy tinh phải được rửa sạch, tráng lại bằng aceton, để khô tự nhiên.

- Cho bi thủy tinh vào tỷ trọng kế. Cân tỉ trọng kế rỗng và bi thủy tinh (mo). - Cho nước cất vào đầy tới cổ bình, đậy nút, lau khô phần nước trào. Cân khối lượng cả bình, bi thủy tinh và nước cất (m1).

- Thay nước cất bằng tinh dầu cũng theo các cách thức như trên. Cân khối lượng cả bình và tinh dầu (m2)

- Lưu ý: Tất cả các công việc nói trên đều phải thực hiện ở cùng một nhiệt độ là 31 oC.

- Sai lệch giữa hai lần xác định liên tiếp không quá 0.001 g. Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của hai lần xác định liên tiếp.

Bảng 3.1. Tỉ trọng của tinh dầu hồ tiêu Bộ phận Phương pháp ly trích Lần đo m0 m1 m2 31 31 d 1 25.5335 29.8912 29.3386 2 25.5334 29.8911 29.3385 CHHD 3 25.5335 29.8912 29.3386 0.8732 1 25.5335 29.8920 29.3938 2 25.5335 29.8921 29.3939 LÁ MIHD 3 25.5336 29.8920 29.3938 0.8857 1 25.5334 29.8915 29.2321 2 25.5334 29.8914 29.2320 CHHD 3 25.5335 29.8915 29.2321 0.8487 1 25.5334 29.8955 29.2508 2 25.5335 29.8954 29.2507 QỦA MIHD 3 25.5335 29.8955 29.2508 0.8522 3.5.2 Chỉ số khúc xạ 3.5.2.1 Lý thuyết

Chỉ số khúc xạ còn gọi là chiết suất, là tỉ số giữa sin góc tới và sin góc khúc xạ của một tia sáng có độ dài sóng xác định đi từ không khí qua tinh dầu ở nhiệt độ xác định.

Người ta thường dùng ánh sáng của đèn natrium (D) có độ dài sóng 589,9 ± 0,3

nm. Nhiệt độ tham chiếu là 20 oC (trừ trường hợp tinh dầu không thể ở thể lỏng tại nhiệt độ này thì phải chọn 25 hoặc 30 oC.

Chỉ số khúc xạ, được tính theo công thức:

Với:

: chỉ số khúc xạ ở nhiệt độ qui định t = 20 oC : chỉ số khúc xạ đo ở nhiệt độ

3.5.2.2 Thực hành Dụng cụ

Sử dụng khúc xạ kế Shanghai Physico–Optical Instrument factory WYA-S ABBE REFRACTOMETER

Hình 3.5. Khúc xạ kế

Thao tác

- Rửa sạch nơi chứa mẫu bằng aceton. Sau đó cho tinh dầu hồ tiêu lên nơi chứa mẫu.

- Bật công tắc và kéo ngọn đèn gần với nơi chứa mẫu.

- Chỉnh nút để thấy rõ được hai vùng sáng tối trong mẫu. Ranh giới giữa hai vùng cũng là đường cắt ngang của hình chéo.

- Bấm nút “Read” để đọc chỉ số khúc xạ. Bấm nút “Tempt” để xem nhiệt độ.

Bảng 3.2. Chỉ số khúc xạ của tinh dầu hồ tiêu Bộ phận Phương pháp ly trích Lần đo 33' D n n 33D 1 1.4772 2 1.4761 CHHD 3 1.4779 1.4824 1 1.4745 2 1.4776 LÁ MIHD 3 1.4755 1.4810 1 1.4716 2 1.4712 CHHD 3 1.4732 1.4770 1 1.4825 2 1.4837 QUẢ MIHD 3 1.4871 1.4898

3.5.3 Góc quay cực

3.5.3.1 Lý thuyết

Hầu hết tinh dầu đều có tính quang hoạt, nghĩa là có khả năng làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực khi ánh sáng này đi xuyên qua. Khả năng làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực của mỗi tinh dầu hầu như đều khác nhau và biểu thị bằng góc quay cực.

Góc quay cực của tinh dầu (kí hiệu ), được tính bằng độ, là góc quay mặt phẳng ánh sáng phân cực của ánh sáng có độ dài sóng là 589,3 ± 0.3 nm, khi ánh

sáng này được truyền ngang qua một ống chứa tinh dầu dài 0,5 dm trong những điều

kiện nhất định.

Những tinh dầu làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực theo chiều kim đồng

hồ gọi là tinh dầu hữu triền (+, d) và ngược lại gọi là tinh dầu tả triền (-, d).

Để xác định góc quay cực người ta thường dùng các loại triền quang kế dùng

đèn natrium hoặc kính lọc màu vàng da cam, điều chỉnh bằng tay hay tự động hiện

số.

Góc quay cực của phần lớn các loại tinh dầu rất ít thay đổi theo nhiệt độ, do đó có thể xác định ở nhiệt độ phòng.

3.5.3.2 Thực hành

Dụng cụ

- Triền quang kế WXX – 2 AUTOMATIC POLARIMETER.

Thao tác

Đo góc quay cực của tinh dầu tiêu ở nhiệt độ t = 22 oC và λ = 589 nm bằng triền quang kế.

- Bật nguồn sáng cho đến khi đạt được cường độ sáng.

- Cho tinh dầu vào đầy ống thử và đậy nắp lại. Cần phải chú ý không để lẫn bọt không khí vào ống.

- Đặt ống vào triền quang kế, đọc góc quay quan sát và ghi nhận chiều quay. - Chú ý: phải hiệu chỉnh trước triền quang kế về 0 với ống không chứa tinh dầu.

Bảng 3.3. Góc quay cực của tinh dầu hồ tiêu

Bộ phận Phương pháp ly trích Lần đo Góc quay cực α22D

1 +1o314’ 2 +1o316’ CHHD 3 +1o315’ +2o630’ 1 +1o423’ 2 +1o426’ LÁ MIHD 3 +1o425’ +2o849’ 1 -0o325’ 2 -0o328’ CHHD 3 -0o322’ -0o649’ 1 -3o589’ 2 -3o586’ QUẢ MIHD 3 -3o043’ -7o172’ Hình 3.6. Triền quang kế

3.6 CHỈ SỐ HÓA HỌC 3.6.1 Chỉ số acid

Chỉ số acid (AI) là số mg hidroxid kalium cần thiết để trung hòa các acid tự do có trong 1 g tinh dầu.

Cùng một loại tinh dầu chỉ số acid thay đổi tùy thuộc vào phương pháp khai thác và thời gian tồn trữ. Trong các tinh dầu tồn trữ lâu hợp chất ester bị thủy giải hoặc các hợp chất aldehid bị oxid hóa nên chỉ số acid thường cao hơn các tinh dầu mới sản xuất

KOH trung hòa acid tự do trong tinh dầu theo phản ứng: RCOOH + KOH → RCOOK + H2O

Từ lượng KOH và khối lượng mẫu tinh dầu đã sử dụng, suy ra chỉ số acid