2.3.2.1. Gây mô hình HCRKT thể can uất tỳ hư theo phương pháp của Bradessi [44]
Chuột nhắt trắng 80 con đủ tiêu chuẩn thí nghiệm được chia thành 4 lô nghiên cứu, mỗi lô 20 con :
- Lô 1, lô 2, lô 3: Gây mô hình HCRKT trong 10 ngày. - Lô 4 : Được nuôi trong điều kiện bình thường.
Cách tiến hành gây mô hình HCRKT: Chuột nhắt trắng được cho vào ống nhựa hình trụ và đặt vào hệ thống giá đỡ, đầu có chốt hãm ở trên. Đồng thời phía dưới hệ thống giá đỡ ta đặt máng có vách ngăn chia từng ô tương ứng với từng ống nhựa. Sau đó toàn bộ hệ thống giá đỡ được ngâm trong nước ở nhiệt
độ 22 ± 1°C. Mức nước ngâm cách đầu trên của ống hình trô khoảng 2cm. Chuột được ngâm nước liên tục 1 giờ/ngày x 10 ngày.
Ảnh 2.2 : Chuột được nhốt trong các ống hình trụ và bị ngâm nước trong 1h
Mục tiêu của mô hình: Biểu hiện trên chuột bằng các rối loạn về thể trạng, rối loạn tính chất phân, sự phát thải phân, rối loạn về hành vi.
2.3.2.2. Phương pháp nghiên cứu điều trị HCRKT
Sau khi gây được mô hình HCRKT ở 3 lô nói trên. Chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu như sau :
- Lô 1 : Sau gây mô hình HCRKT trong 10 ngày, cho uống 0,5ml nước cất trong 10 ngày tiếp theo.
- Lô 2 : Sau gây mô hình HCRKT trong 10 ngày, cho uống thuốc sắc bài TTYP với liều 0,5ml có 0,5g dược liệu cho từng con chuột, uống liên tục trong 10 ngày tiếp theo.
- Lô 3 : Sau gây mô hình HCRKT trong 10 ngày, cho uống viên nang TTYP (dạng bào chế hiện đại). Liều lượng 0,5ml có 17,28mg thuốc pha thành dung dịch cho từng con chuột, uống liên tục trong 10 ngày tiếp theo.
Cả 3 lô nghiên cứu (1,2,3) đều được uống nước cất và thuốc tương ứng như trên vào 8h sáng hàng ngày [71].
2.3.2.3. Các chỉ tiêu theo dõi
Các chỉ tiêu được lấy tại 3 thời điểm:
- Trước khi tiến hành thực nghiệm (điều kiện bình thường, chuột khoẻ mạnh).
- Sau khi gây mô hình HCRKT 10 ngày.
- Sau khi điều trị thuốc 10 ngày.
(1). Theo dõi trọng lượng chuột tại 3 thời điểm như trên.
(2). Đếm số lượng phân cứ mỗi 15 phót (trong 1 giê) trong quá trình ngâm nước tại 2 thời điểm trước và sau gây mô hình. Chuột ở lô chứng được đặt vào các lồng riêng biệt cùng thời gian như trên.
(3). Nhận xét tính chất và hình dạng phân (rắn, lỏng, khuôn, có màng nhầy...). (4). Xác định tỷ lệ nước trong phân của các nhóm tại 3 thời điểm như trên.
+Phương pháp tính lượng nước trong phân:
- Từng chuột được nhốt trong các lồng riêng. - Thu thập phân mới trong vòng 1 giê.
- Phân được cân xác định trọng lượng bằng cân điện tử chính xác tới miligram.
- Sấy phân ở nhiệt độ 100°C trong vòng 24 giê. - Cân lại phân sau khi sấy khô.
- Lượng nước trong phân được tính theo công thức sau: W(%) = x100
F D
F
W - Hàm lượng nước có trong phân. F - Trọng lượng phân tươi.
(5). Xét nghiệm định lượng Serotonin trong máu chuột tại 3 thời điểm như trên. - Serotonin là một sản phẩm trung gian của quá trình trao đổi chất tryptophan và nằm chủ yếu trong các tế bào ưa crom của ruột, tế bào thần kinh của não, tiểu cầu của máu và là chất dẫn truyền thần kinh trong hệ thần kinh trung ương.
- Hầu như tất cả Serotonin trong máu tuần hoàn tập trung ở tiểu cầu. Sự biến đổi nồng độ Serotonin trong máu trước và sau khi gây HCRKT là một tiêu chuẩn để xác định đã gây được HCRKT trên chuột. Đồng thời, sự biến đổi serotonin trước và sau điều trị TTYP cũng là một tiêu chuẩn đánh giá kết quả điều trị HCRKT.
+ Phương pháp tiến hành:
- Cho chuột uống sữa trước khi lấy máu 1h.
- Dùng Pipet lấy 0,3ml máu từ khóe mắt chuột và được chống đông bằng EDTA trong từng ống nghiệm, đánh số tương ứng với số đánh dấu trên chuột.
- Ly tâm để tách các thành phần hữu hình của máu.
- Huyết tương được bảo quản ngay ở điều kiện -20°C cho đến khi tiến hành định lượng.
- Định lượng Serotonin huyết tương bằng phương pháp ELISA. o Kháng thể đặc hiệu kháng Serotonin được gắn vào đáy giếng.
o Sau khi ủ qua đêm, serotonin trong huyết tương sẽ cạnh tranh với chất chuẩn làm cho giếng sau khi bắt màu sẽ nhạt hơn.
o Độ hấp thụ quang học được đo ở bước sãng 405nm.
(6). Xác định các rối loạn hành vi thông qua 2 bài tập Test.
Bài Test khám phá không gian mở
Chuột có tính tò mò, luôn có xu hướng khám phá không gian mới để thu thập thông tin mới của môi trường, qua đó bảo đảm sự an toàn cho bản thân động vật. Đối với hành vi khám phá trong không gian mở là một hình trụ tròn, chuột sẽ có xu hướng sử dụng thời gian nhiều hơn ở vùng ngoại vi so với vùng trung tâm. Phân bố thời gian sẽ thay đổi ở chuột bị rối loạn hành vi, cảm xúc.
* Phương pháp:
Chuột được đặt vào trung tâm của khối hình trụ có đường kính 80cm, cao 50cm. Với thời gian 10 phót, chuột được tự do khám phá không gian mới. Trong quá trình này, camera và máy tính tự động ghi lại quãng đường, thời gian và số lần tiến vào vùng trung tâm và ngoại vi. Chuột bị stress thường có xu hướng sử dụng thời gian ở vùng ngoại vi nhiều hơn so với nhóm chứng. Để bảo đảm tính mới của môi trường, mỗi lô chuột chỉ được ghi hành vi khám phá một lần duy nhất tại các thời điểm khác nhau.
Bài Test hành vi cộng đồng * Nguyên lý:
Chuột là động vật có tính cộng đồng rất cao. Chúng luôn có nhu cầu tiếp xúc với đồng loại, đặc biệt là khi bị nuôi cách ly. Hành vi này thay đổi rất lớn đối với chuột bị tác nhân stress.
* Phương pháp:
Hệ thống thí nghiệm gồm một bể nhựa trong suốt có diện tích đáy (30cm x100 cm), cao 50 cm, được ngăn thành 3 khoang.
- Khoang 1 (khoang trái) = 30cm x 40 cm.
- Khoang 2 (khoang giữa) = 30cm x 20 cm.
- Khoang 3 (khoang phải) = khoang 1 (khoang trái).
Ba khoang nối với nhau bằng hai cửa nằm sát trên bề mặt sàn có kích thước 10 x 10 cm.
Khoang 1 và 3, mỗi khoang chứa một hộp lưới có thể tích 10x10x10cm. Phía trên hộp lưới được đậy nắp và quây kín để tránh chuột trèo lên.
Mét camera và máy tính tự động đặt cách phía trên bể nhựa khoảng 100 cm ghi lại hành vi của chuột.
Chuột thí nghiệm được đặt vào khoang giữa, và được tự do đi lại giữa các khoang trong vòng 5 phót để làm quen với môi trường mới
Sau 5 phót chuột thí nghiệm được đưa lại vào khoang giữa. Hộp lưới tại khoang 3 nhốt một chuột đực khoẻ mạnh. Hộp lưới tại khoang 1 để trống.
Chuột thí nghiệm được tự do đi lại trong cả 3 khoang và tiếp xúc với chuột đực được nhốt trong hộp lưới tại khoang 3 trong vòng 10 phót.
Hành vi của chuột thí nghiệm được camera và máy tính tự động theo dõi số lần tiến vào mỗi khoang, thời gian ở trong mỗi khoang.
Chuột bị stress có xu hướng Ýt tiếp xúc với đồng loại hơn, số lần vào ra các khoang giảm.
Để bảo đảm tính ổn định của mô hình, mỗi lô chuột chỉ được ghi hành vi cộng đồng một lần duy nhất tại các thời điểm khác nhau.
2.3.2.4. Xử lý số liệu
Các số liệu thu thập được phân tích, xử lý theo phương pháp thống kê y sinh học, có so sánh trước – sau trên phần mềm Microsoft Excel 2007.
- So sánh 2 tỷ lệ dùng thuật toán Chitest
- So sánh 2 giá trị trung bình trước và sau thực nghiệm dùng test trước- sau.
- So sánh giữa các nhóm dùng T-test Student. - Các tính toán có ý nghĩa thống kê khi P < 0,05.
Chương 3
Kết quả nghiên cứu