Phương pháp nuođi cây tê bào lympho máu ngối vi người

 Chuaơn bị dúng cú.

Danh múc dúng cú caăn chuaơn bị goăm:

Lĩ thụy tinh đựng mođi trường 100 – 500 ml. Lĩ nuođi cây tê bào 10ml.

Nút cao su.

Micro pipet (pipetman). Pipet pasteur.

Tât cạ dúng cú cho thao tác nuođi cây đeău phại là thụy tinh trung tính được rửa sách các vêt baơn và hoá chât, được vođ trùng nhieơt, tiên hành theo các bước nghieđm ngaịt sau:

Rửa dúng cú baỉng xà phòng  tráng sách baỉng nước thường  ngađm trong dung dịch NaOH 5% trong 5 giờ  tráng sách baỉng nước thường ngađm trong dung dịch HCl 5% trong 5 giờ  tráng sách baỉng nước thường  ngađm và tráng lái 2 laăn baỉng nước cât  sây khođ, làm nút bođng, đóng gói  hâp tieơt trùng 1 atm trong 30 phút  bạo quạn.

 Chuaơn bị mođi trường nuođi cây tê bào. * Thành phaăn hoá chât:

Mođi trường boơt F10 (Difco).

PHA – Phytohemaglutinin (Sigma). Fetal calf serum (Gibco).

Litium Heparine 400U. L-glutamine.

Kanamicine. Colchicine

 Mođi trường cơ bạn:

Hoên hợp goăm 197.9 g mođi trường boơt F10 + 24gr NaHCO3 + 20 lít nước cât 2 laăn đã kieơm tra chí nhieơt tô. Laĩc cho tan hêt. Chưnh pH dung dịch baỉng NaHCO3 và HCl veă pH = 7.2 - 7.4. Lĩc vođ trùng baỉng filter 0.22m. Bạo quạn lạnh.

Huyêt thanh vođ trùng được bât hốt ở nhieơt đoơ 560C / 1 giờ. Heparine pha loãng trong nước cât vođ trùng đên 400 E / 1 ml. Kanamicine 20 000U trong nước cât vođ trùng.

L – glutamin pha loãng đên 200 mM. Lĩc vođ trùng. PHA: 5 ml nước muôi sinh lý vođ trùng / lĩ.

Colchicine: Pha loãng trong nước cât vođ trùng đên 160g/ lít.

 Mođi trường nuođi cây:

Tât cạ hoá chât, mođi trường cơ bạn đeău phại vođ trùng và được bạo quạn ở đieău kieơn lánh sađu (-100C đên -200C ).

Mođi trường nuođi cây được chuaơn bị ngay trước khi tiên hành nuođi cây theo cođng thức:

Mođi trường cơ bạn: 100 ml. Huyêt thanh thai bò: 15 ml. Heparin 400 E: 12.5 ml. Kanamicine: 0.6 ml. PHA: 5 ml.

 Thường qui nuođi cây tê bào lympho máu ngối vi người.

Thường qui kỹ thuật nuơi cấy tế băo lympho mâu toăn phần được thực hiện theo câc bước sau:

+ Máu ven được lây baỉng dúng cú vođ trùng, trong đieău kieơn thao tác vođ trùng. Mău máu được bạo quạn với heparine chông đođng ở 40C.

+ Chuẩn bị mơi trường nuơi cấy 370C trong ống plastic vơ trùng hoặc lọ thuỷ tinh trung tính vơ trùng (10 ml mơi trường /ống 15 ml hoặc 5 ml mơi trường / lọ 10 ml).

+ Thím mâu toăn phần văo ống nuơi cấy, lắc đều, đặt nghiíng trong khay nước 370 C, sau đĩ chuyển văo tủ 370C. Thời gian ủ 48 giờ.

+ Tại thời điểm 46 giờ, câc ống nuơi cấy được thím 50 µl dung dịch colchicine 160 µg/l.

+ Thu hoạch ở thời điểm nuơi cấy đạt thời gian 48 giờ. 2.2.2. Phương pháp cô định tê bào, làm tieđu bạn hieơn vi.

 Phương pháp cô định tê bào.

+ Chuyeơn huyeăn dịch nuođi cây vào ông ly tađm 6ml, ly tađm 800 –1000 vòng / phút trong thời gian 7 phút. Sau đó, lây tê bào và laĩc nhé cho tan tê bào trong 5ml hoên hợp dung dịch nhược trương KCl 0.075M + citratnatri 1% trư leơ 3 :1, giữ oơn nhieơt 37oC / 20 phút.

+ Ly tađm laăn 2, 800 – 1000 vòng / phút / 7 phút, lây caịn tê bào, làm tan lái trong 5ml dung dịch cô định cacnoa (3 theơ tích methanol : 1 theơ tích acid acetic), giữ 5 phút.

+ Tiêp túc ly tađm 800 – 1000 vòng / phút / 7 phút, lây caịn tê bào.

+ Tiêp túc thay mới dung dịch cô định và ly tađm 2 laăn nữa đeơ rửa trođi các mạnh táp có trĩng lượng thâp hơn tê bào.

Cuôi cùng, caịn tê bào được hoà tan trở lái trong 0,50 ml dung dịch cô định đeơ làm tieđu bạn.

 Phương pháp làm tieđu bạn hieơn vi.

+ Lây dịch tê bào sau cố định nhỏ giĩt đeău tređn các lam kính (đã được xử lý NaOH, HCl, ngađm nước cât, lau khođ, nhúng qua eter ethylen).

+ Đaịt lam kính đã nhỏ dịch tê bào leđn máy sây lót vại ướt ở nhieơt đoơ 65oC/ 100 giađy.

+ Sau đó, đeơ lam kính khođ tự nhieđn và tiên hành nhuoơm nhieêm saĩc theơ.

 Nhuoơm nhieêm saĩc theơ.

+ Lam kính sau khi đeơ khođ tự nhieđn được xử lý ethanol 70% / 5 phút, đaịt leđn giá cho ráo roăi laĩp vào buoăng nhuoơm với dung dịch gemsa pha loãng trong đeơm PBS / 20 phút.

+ Lây tieđu bạn ra khỏi buoăng nhuoơm, rửa trođi tređn vòi nước và nhúng vào dúng dịch PBS, đeơ khođ tự nhieđn.

+ Kieơm tra đoơ baĩt màu cụa NST, giữ sách tieđu bạn hoaịc dùng keo đaơy lamen lái đeơ bạo quạn.

2.2.3. Thiêt kê thí nghieơm xử lý cadmi, gamma.

Máu ngối vi toàn phaăn sau khi lây từ tĩnh mách người cho, đã chông đođng trong heparine được phađn phôi vào các lĩ thụy tinh vođ trùng (lĩ có dung tích 1ml).

Taơp hợp các lĩ lây từ moơt mău máu được đem chiêu xá ở các lieău khác nhau và sô lĩ mău tùy theo sô đieơm dự định khạo sát.

Mău chiêu rieđng từng lĩ tređn nguoăn Co60 tái Vieơn Nghieđn cứu hát nhađn, moêi lĩ đeău được gaĩn thỏi TLD đeơ kieơm soát lieău chính xác.

 Nguyeđn taĩc xử lý cadmi.

Cadmi được pha loãng trong dung dịch HNO3 0.1M đên noăng đoơ 100g/ml trước khi dùng xử lý mău. Các mău được xử lý trong tình tráng nuođi cây tê bào khođng có PHA, lieău lượng cadmi phú thuoơc vào bô trí thí nghieơm. Thời đieơm xử lý cadmi được tiên hành trước hoaịc sau chiêu xá.

 Thiêt kê các toơ hợp thí nghieơm và phương thức xử lý mău. * Xử lý đơn với cadmi.

Xử lý đơn cadmi được thực hieơn trong mođi trường F10 khođng có PHA và serum theo thiêt kê bạng 2.1.

Bạng 2.1: Thiêt kê các toơ hợp thí nghieơm đánh giá ạnh hưởng cụa cadmi leđn tê

STT Noăng đoơ xử lý Cd (g/ml) Theơ tích xử lý (ml) 1 0 5 2 0.05 5 3 0.10 5 4 0.20 5 5 0.5 5 6 1.0 5 7 2.0 5

Sau thời gian xử lý, mău máu được chuyeơn sang các ông chứa mođi trường nuođi cây với đụ thành phaăn có sô ký hieơu tương ứng.

Tiên hành quá trình nuođi cây tê bào.

 Xử lý mău có sự phôi hợp giữa cadmi và bức xá gamma.

Toàn boơ thiêt kê thí nghieơm đưa đên sự phôi hợp giữa noăng đoơ cadmi và các lieău bức xá gamma, đoăng thời theơ hieơn được vai trò ngaín cạn phúc hoăi toơn thương phóng xá.

Tređn cơ sở như vaơy, vieơc thiêt kê đoăng thời đạm bạo hai heơ thông xử lý cadmi trước và sau chiêu xá. Thí nghieơm được thực hieơn theo thiêt kê bạng 2.2.

Bạng 2.2: Các toơ hợp thí nghieơm đánh giá ạnh hưởng phôi hợp cụa cadmi và bức xá gamma leđn tê bào lympho người.

Phương thức xử lý Noăng đoơ cadmi

(g/ml)

Cd100g/ml (g/5ml mău)

Lieău bức xá gamma (Gy) 0 0.75 1.0 1.5

Xử lý Cd(NO3)2

trong mođi trường thiêu PHA / 37oC trước chiêu xá 3h 0 0 1 4 7 10 0.05 2.50 2 5 8 11 0.10 5.00 3 6 9 12 Xử lý Cd(NO3)2 trong mođi trường thiêu PHA / 37oC sau chiêu xá 3h 0 0 - - - - 0.05 2.50 - 17 20 23 0.10 5.00 - 18 21 24

Theo đó, chuaơn bị 18 lĩ vođ trùng. Chuaơn bị huyeăn dịch máu toàn phaăn trong mođi trường nuođi cây thiêu PHA và serum tỷ leơ 1/3 (6ml máu vođ trùng trong 18 ml mođi trường). Chia ra các lĩ nuođi cây và xử lý cadmi cho các nhóm lĩ A, B, C. + A : 5ml + Cd 0 g/ml + B : 5ml + Cd 0.05 g/ml (2.5 l cụa dung dịch Cd 100 g/ml) + C : 5ml + Cd 0.10 g/ml ( 5 l cụa dung dịch Cd 100 g/ml) + 17, 18, 20, 21, 23 và 24 moêi lĩ 1ml. Ụ tât cạ các lĩ mău ở 37o C / 3h. Lây từ + A ra 4 lĩ : 1, 4, 7, 10 moêi lĩ 1ml.

+ B ra 4 lĩ : 2, 5, 8, 11 moêi lĩ 1ml. + C ra 4 lĩ : 3, 6, 9, 12 moêi lĩ 1ml. Tách nhóm : + Nhóm I : goăm các lĩ 1, 2, 3 + Nhóm II : 4, 5, 6, 17, 18. + Nhóm III : 7, 8, 9, 20, 21. + Nhóm IV : 10, 11, 12, 23, 24.

Sau đó, chuyeơn tât cạ các lĩ mău đã được phađn nhóm đên nguoăn Co60. Thực hieơn chiêu xá nhóm I lieău 0 Gy, nhóm II lieău 0.75 Gy, nhóm III lieău 1.0 Gy, nhóm IV lieău 1.5 Gy.

Giữ nhieơt đoơ 37oC theđm 3h.

Chuaơn bị 100ml mođi trường nuođi cây đaăy đụ thành phaăn PHA, serum, colchicine, đát nhieơt đoơ 37oC .

Chia ra 18 lĩ ( dung tích 10ml), moêi lĩ 4ml, đánh sô từ 1 – 12, 17, 18, 20, 21, 23 và 24. Boơ sung dung dịch cadmi theo nhóm các lĩ 1,4,7,10 moêi lĩ 0l; các lĩ 2, 5, 8, 11 moêi lĩ 2l; các lĩ 3, 6, 9, 12 moêi lĩ 4l; các lĩ 17, 20, 23 moêi lĩ 2.5l; các lĩ 18, 21, 24 moêi lĩ 5l.

2.3 Phương pháp phađn tích sai hình nhieêm saĩc theơ.

 Phađn tích chư sô phađn bào nguyeđn nhieêm (MI).

Chư sô phađn bào nguyeđn nhieêm được đánh giá ở tât cạ các nghieơm thức từ xử lý đơn đên xử lý phôi hợp. Quan sát tređn kính hieơn vi với đoơ phóng đái 10 x 40, quét lieđn túc theo hình chữ Z, baĩt đaău baỉng moơt mitose, kêt thúc cũng baỉng moơt mitose.

Chư sô phađn bào nguyeđn nhieêm (mitotic index) = Tỷ leơ % cụa (phađn bào nguyeđn nhieêm / tê bào + mitose).

 Phađn tích sai hình nhieêm saĩc theơ.

Nhaơn dáng và đieău kieơn thoạ mãn đeơ kêt luaơn kieơu sai hình nhieêm saĩc theơ

được tiên hành tređn quan sát hieơn vi 1000x hoaịc ạnh kỷ thuaơt sô.

 Kieơu sai hình đa tađm: Có câu trúc 2 tađm đoơng trở leđn.

Ở chu kỳ phađn bào đaău tieđn, câu trúc 2 tađm được hình thành do lieđn kêt 2 mạnh chứa tađm từ kêt quạ 2 toơn thương DSB ở 2 nhieêm saĩc theơ khác nhau trước pha S, cùng với sự hình thành câu trúc 2 tađm thì 2 mạnh khođng tađm cũng có theơ lieđn kêt với nhau hoaịc khođng. Như vaơy, tê bào chứa 1 sai hình 2 tađm có theơ chứa 1 hoaịc 2 mạnh khođng tađm, sô lượng đơn vị nhieêm saĩc sẽ là 46 hoaịc 47.

Tương tự như vaơy, sự xuât hieơn 1 sai hình 3 tađm sẽ kèm theo 2, 3 hoaịc 4 mạnh khođng tađm.

 Kieơu sai hình mạnh khođng tađm:

Câu trúc khođng có tađm đoơng, do mạnh từ 1 toơng thương DSB hoaịc lieđn kêt 2 mạnh từ 2 toơng thuương DSB. Như vaơy, sự hieơn dieơn 1 mạnh gaĩn lieăn với 1 hoaịc 2 nhieêm saĩc theơ ngaĩn hơn bình thường.

 Kieơu sai hình minute:

Câu trúc này gaĩn lieăn với sự xuât hieơn 1 câu trúc dogleg hoaịc do mạnh quá bé. Như vaơy, sự xuât hieơn minute làm taíng sô đơn vị nhieêm saĩc theơ trong boơ nhieêm saĩc theơ.

 Kieơu sai hình vòng:

Câu táo từ sự lieđn kêt 2 đaău mât giới hán cụa đốn giữa 1 nhieêm saĩc theơ bị 2 toơn thương DSB. Vòng có theơ có tađm hoaịc khođng có tađm. Sự xuât hieơn cụa vòng

có tađm sẽ kèm theo 1 hoaịc 1 vài mạnh khođng tađm, vòng khođng tađm sẽ kèm theo 1 nhieêm saĩc theơ ngaĩn hơn hoaịc 1 nhieêm saĩc theơ ngaĩn hơn với 1 mạnh khođng tađm.

 Kieơu sai hình chuyeơn đốn:

Ngay trong cùng 1 chu kỳ tê bào, bieơu hieơn cụa sai hình chuyeơn đốn là do lieđn kêt tương hoê cụa đốn mât giới hán có tađm với đốn mât giới hán khođng tađm từ nhieêm saĩc theơ khác, chuyeơn đốn làm xuât hieơn 1 nhieêm saĩc theơ dài hơn và 1 nhieêm saĩc theơ ngaĩn hơn bình thường trong karyotype.

 Kieơu đứt gãy nhieêm saĩc tử:

 Kieơu sai hình đạo đốn: Do 2 toơn thương DSB tređn cùng 1 nhieêm saĩc theơ.

Chuyeơn đốn khođng làm thay đoơi kích thước nhieêm saĩc theơ nhưng làm thay đoơi vị trí cụa tađm đoơng.

Câu trúc goăm 2,3,4 nhieêm saĩc theơ lieđn kêt với nhau theo môi lieđn kêt nhieêm saĩc tử – nhieêm saĩc tử, các đốn tương đoăng cụa câu trúc táo neđn hình dáng đaịc bieơt.

Sô lieơu sai hình ở moêi quan sát phại được giại thích baỉng qui luaơt hình thành sai hình nhieêm saĩc theơ từ toơn thương phađn tử ADN.

Nhaơn biêt và phađn tích các kieơu sai hình nhieêm saĩc theơ được kêt hợp tređn cơ sở phađn lối sai hình cụa Savage với cơ chê hình thành sai hình NST từ các toơn thương DSB.

2.4 Phương pháp xử lí sô lieơu.

* Chư sô phađn bào nguyeđn nhieêm (MI).

MI = % ( tê bào phađn chia /  (tê bào phađn chia + nhađn tê bào lympho). * Phoơ phađn lối kieơu sai hình NST.

Toàn boơ các kieơu sai hình quan sát được tređn tieđu bạn. * Taăn sô sai hình nhieêm saĩc theơ.

Taăn sô sai hình được tính rieđng cho từng kieơu sai hình được phát hieơn, taăn sô sai hình = % ( sai hình /  boơ nhieêm saĩc theơ đụ sô lượng).

* Trung bình mău và phương sai theo cođng thức :

X = n X n Xn X X n i i       1 2 1 ....

S =    1 1 2     n X X n i i Trong đó:

X : giá trị trung bình mău.

i

X : Kêt quạ giá trị trung bình cụa mău thứ i. n : Sô lượng mău.

S: là phương sai mău.

CHƯƠNG 3

KÊT QUẠ NGHIEĐN CỨU VAØ BAØN LUAƠN.

3.1 Nghieđn cứu ạnh hưởng cụa cadmi (Cd2+) leđn chư sô phađn bào nguyeđn nhieêm và sai hình nhieêm saĩc theơ ở tê bào lympho người phơi nhieêm nguyeđn nhieêm và sai hình nhieêm saĩc theơ ở tê bào lympho người phơi nhieêm

in vitro lieău đơn.

3.1.1 Chư sô phađn bào nguyeđn nhieêm ở tê bào lympho xử lý cadmi lieău đơn. đơn.

Nghieđn cứu nhaỉm khạo sát khạ naíng gađy đoơc tê bào cụa cadmi. Lối hieơu ứng được sử dúng đeơ đánh giá tính gađy đoơc tê bào là sự giạm chư sô phađn bào

nguyeđn nhieêm in vitro.

Theo thiêt kê cụa thí nghieơm, lieău lượng cadmi được sử dúng naỉm trong giới hán từ 0.05 – 2.00 µg/ml. Như vaơy, nêu sử dúng cùng dung dịch mé thì sẽ xạy ra tình tráng ạnh hưởng cụa pH ở vùng lieău cao (cadmi được bạo quạn trong HNO3 0.1 M).

Đeơ giạm thieơu ạnh hưởng cụa HNO3 0.1M, thí nghieơm được thực hieơn với 2 noăng đoơ gôc cadmi 1000 µg/ml và cadmi 100 µg/ml. Do đó, các caịp noăng đoơ hơn kém nhau 10 laăn đeău có cùng lượng HNO3 0.1M (ví du:ï noăng đoơ 0.05 µg/ml cũng có lượng HNO3 giông như noăng đoơ 0.5g/ml... (bạng3.1)).

Chư sô phađn bào nguyeđn nhieêm (MI) = %Sô mitose / (lympho + mitose). Chư sô phađn bào nguyeđn nhieêm được tiên hành khạo sát tređn tât cạ các noăng đoơ thí nghieơm.

Tieđu bạn cụa moêi lốt thí nghieơm được quét 3 đường (2 ngang 1 dĩc hoaịc 2 dĩc 1 ngang) baỉng vaơt kính 40x. Sô lieơu thông keđ kêt quạ khạo sát chư sô phađn bào nguyeđn nhieêm được ghi nhaơn tređn bạng 3.1.

Bạng 3.1. Sô kieơu khạo sát chư sô phađn bào nguyeđn nhieêm cụa tê bào lympho tređn heơ thông thử nghieơm máu toàn phaăn xử lý lieău đơn cadmi.

Lốt Noăng đoơ Cd (µg/ml) Theơ tích xử lý (ml) Lượng HNO3 0.1M (µl) tê bào

mitose Chư sô mitose 1 2 3 4 5 6 7 1 0 5 0 2772 66 2.370.08 2 0.05 5 2.5 1865 45 2.24 0.08 3 0.10 5 5.0 1952 38 1.950.06 4 0.20 5 10 2161 40 1.860.07 5 0.50 5 2.5 3222 50 1.560.07 6 1.00 5 5.0 2103 28 1.330.06 7 2.00 5 10 2061 31 1.200.05

Tređn bạng 3.1, coơt 4 chư lượng dung dịch HNO3 có cadmi được sử dúng. Như vaơy, toàn boơ thiêt kê thí nghieơm có 2 taơp hợp lượng HNO3. Theo đó, có theơ so sánh caịp noăng đoơ cadmi hơn kém nhau 10 laăn đeơ đánh giá ạnh hưởng cụa pH. Nêu chư do ạnh hưởng cụa pH thì sô lieơu veă chư sô phađn bào nguyeđn nhieêm sẽ phại giông nhau theo caịp giữa 2 và 5; 3 và 6; 4 và 7.

Kêt quạ thực tê thu được như sau: các lốt thí nghieơm có lượng HNO3 giông nhau (2 so với 5; 3 so với 6 và 4 so với 7) cho thây chư sô phađn bào nguyeđn nhieêm có sự khác nhau rõ reơt (2.24% so với 1.56%; 1.95% so với 1.33%; 1.86%