Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật
- Xác định mật độ vi sinh vật (theo TCVN 7185 – 2002: Phân hữu cơ vi sinh vật). Mật độ vi sinh vật được xác định dựa trên phương pháp nuôi cấy trên môi
trường thạch đĩa, tính số lượng vi sinh vật trên mililit hoặc trên gam mẫu thông qua số khuẩn lạc phát triển trong các đĩa môi trường.
Cân 10g mẫu hoà với 90ml nước cất vô trùng, đem lắc mẫu ở máy lắc có tốc độ 250 vũng/Phút trong 1 tiếng. Sau đó, hút 1ml dịch sau lên men, chuyển sang ống nghiệm thứ nhất có chứa 9 ml nước cất vô trùng, trộn bằng máy voltex. Lặp lại lần thứ ba, thứ tư… tới nồng độ thích hợp để tỏch cỏc khuẩn lạc. Hỳt 200àl dung dịch đã pha loãng cho vào đĩa petri có môi trường đặc hiệu với mỗi loại vi sinh vật. Trang thật đều trên bề mặt thạch. Đặt vào tủ 300C trong 3 ngày sau đó lấy ra đếm số khuẩn lạc vi sinh vật.
Cách tính số lượng vi sinh vật trong mẫu phân tích
Số lượng vi sinh vật trung bình có trong 1ml hay 1g mẫu (N) được tính theo công thức: N = ∑C / f (n1 - 0,1n2)
∑C - tổng số đếm được trên tất cả các đĩa
n1- số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1 (độ pha loãng thấp nhất)
n2 - số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ hai (độ pha loãng tiếp theo) f - hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ 1
- Xác định khả năng thủy phân tinh bột (Theo phương pháp của Cowan và
Steel 1990) [15].
Trên môi trường cơ sở (tùy từng loại vi sinh vật), bổ sung với tỷ lệ 1% tinh bột tan, rồi khử trùng môi trường ở 1atm trong 30 phút. Phân phối 15ml môi trường cơ sở đã bổ sung tinh bột tan được đun nóng chảy và làm nguội ở 450C vào các hộp Petri vô trùng. Khi môi trường đó đụng và nguội, ta tiến hành cấy chấm điểm chủng vi sinh vật phân lập được (các chủng vi sinh vật đã được hoạt hóa) vào giữa hộp Petri. Sau đó dùng giấy vô trùng gói kín các hộp Petri và đem nuôi cấy ở 30-320C đối với nṍm mụ́c và nấm men, nhiệt độ 370C đối với vi
khuẩn (nhiệt độ phù hợp tùy thuộc vào từng chủng vi sinh vật), theo dõi sự phát triển của vi sinh vật. Sau 2- 5 ngày nhỏ thuốc thử Lugol lên vết cấy để quan sát khả năng phân giải tinh bột. Nếu thuốc thử Lugol không bắt màu quanh vết cấy tức là vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột.
- Xác định khả năng phân giải xelluloza (theo phương pháp của Ogundero- 1982 có cải tiến) [15].
Trên môi trường cơ sở (môi trường thích hợp với mỗi loại vi sinh vật), bổ sung carboxymethylcellulose (CMC) với tỷ lệ 1%, rồi khử trùng môi trường ở 1atm trong 30 phút. Phân phối 15ml môi trường cơ sở đã bổ sung CMC được đun nóng chảy và làm nguội ở 450C vào các hộp Petri vô trùng. Khi môi trường đó đụng và nguội, ta tiến hành cấy chấm điểm chủng vi sinh vật phân lập được (các chủng vi sinh vật đã được hoạt hóa) vào giữa hộp Petri. Sau đó dùng giấy vô trùng gói kín các hộp Petri và đem nuôi cấy ở 30-320C đối với nṍm mụ́c và nấm men, nhiệt độ 370C đối với vi khuẩn (nhiệt độ thích hợp tùy thuộc vào từng chủng vi sinh vật), từ ngày thứ 3 trở đi (sự hình thành vòng sáng xung quanh khuẩn lạc tức sinh enzyme cellulase, thời gian quan sát tùy thuộc từng loại vi sinh vật) quan sát vòng phân giải cellulose được tạo ra quanh vết cấy. Sau 3- 5 ngày nhỏ ngập thuốc thử dung dịch 1% congo đỏ lên vết cấy và làm sạch với 0,1M NaCl, sau đó quan sát khả năng phân giải cellulose. Nếu thuốc thử congo đỏ không bắt màu quanh vết cấy tức là vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose.
- Khả năng phân giải photphat khó tan (TCVN số 6167-1996 : Phân bón vi sinh vật phân giải hợp chất Photpho khó tan). Khả năng phân giải photphat khó tan được xác định bằng phương pháp đo vòng phân giải Ca3(P04)2 trên môi trường đặc; đó là vòng tròn trong suốt bao quanh khuẩn lạc (đối với trường hợp cấy điểm) hoặc lỗ thạch (đối với trường hợp khoan lỗ thạch), nơi mà vi sinh vật phân giải Ca3(P04)2.
- Định danh các chủng vi sinh vật theo phương pháp sinh học phân tử
Các chủng vi sinh vật được phân loại đến loài theo phương pháp phân loại học phân tử dựa trên cơ sở giải trình tự đoạn gien 16s ARN riboxom của các chủng vi vi sinh vật, so sánh với các trình tự có sẵn trong ngân hàng gien quốc tế EMBL bằng phương pháp FASTA 33 để định loại đến loài các chủng vi sinh vật. Cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự đoạn gien mã hóa 16s ARN riboxom của chủng E.coli (J01695), tương ứng với các vị trí nucleotit 15-33 (cho mồi xuôi) và 1548-1532 (cho mồi ngược). Trình tự nucleotit của các chủng nghiên cứu được giải trình tự trên máy tự động ABI-377 của Hãng Perkin-Elmer (Mỹ), sau đó được xử lý bằng chương trình SeqEd1.03 và chương trình AssemblyLIGN 1.9 trong hệ chương trình MacVector 6.5.3 (Oxford Molecular Inc.). Mẫu vi sinh vật được phân tích tại Trung tâm Công nghệ Sinh học-Đại học Quốc gia Hà Nội. Truy cập Ngân hàng Gien bằng chương trình Entrez/nucleotide/ tìm kiếm các trình tự gien 16s ARN riboxom của vi khuẩn. So sánh đối chiếu và xử lý số liệu của tất cả các chuỗi bằng chương trình GENDOC2.5
Các phương pháp xác định thành phần vật lý và hóa học của bã thải trước và sau khi xử lý
- Xác định độ ẩm ( theo Tiêu chuẩn ngành về phân tích phân bón 10TCN – 302 – 97). Cân chính xác 2- 3g mẫu phân tích trên cân phân tích cho vào chén sấy mẫu đã được sấy khô tuyệt đối và cõn trờn cân phân tích chính xác 0,0002g. Đặt chén vào tủ sấy ở nhiệt độ 650C - 700C mở nắp chén trong 2 -3h cho đến khi mẫu không đổi. Đậy nắp chộn đó sấy khô và đưa vào bình hút ẩm để làm nguội tới nhiệt độ phũng ( khụng để quá 1h). Cõn chộn đựng mẫu trên cân phân tích chính xác đến 0,0002g. Độ ẩm được tính
E =
m m m1− 2
m1: Khối lượng chén và mẫu trước khi sấy (g) m2: khối lượng chén và mẫu sau khi sấy (g) m: Khối lượng mẫu phân tích (g)
- Xác định pH bằng máy pH metter điện cực thủy tinh [32a]
- Xác định cỏcbon hữu cơ tổng số (OC %) theo Phương pháp Walkley-Black: Tác động chất hữu cơ với hỗn hợp Kali Bicromat (K2Cr2O7) N/3 trong Axit Sunfuric (H2SO4) 25N và chuẩn độ Bicromat dư bằng muối Mohr (Ferrous Sulphate) với chỉ thị màu BDS (Barium Diphenylamine Sulphonate).[32a]
- Xác định đạm tổng số (N%) Phương pháp Kenđan (Kjeldahl): Phá hủy mẫu bằng Axit Sunfuric, chuyển N hữu cơ về dạng Sunphat Amon - (NH4)2SO4, cho kiềm tác động chuyển về dạng NH3 và được thu vào dung dịch Axit Boric, chuẩn độ với axit tiêu chuẩn (HCl 0,01N). [32a]
- Xác định lân tổng số (P2O5 %): Sử dụng Axit Pecloric cùng H2SO4 phân hủy và hòa tan các hợp chất phốtpho trong đất; xác định hàm lượng lân bằng phương pháp trắc quang (Spectophotometer).[32a]
- Lân dễ tiêu theo Phương pháp Oniani: Chiết rút P trong đất bằng dung dịch H2SO4 0,1N theo tỷ lệ đất/dung dịch là 1/25; so màu trờn mỏy chiết quang có chọn lọc ở bước sóng 882 nm.[32a]
- Xác định hàm lượng HCN theo 10TCN 604:2004
- Xác định hàm lượng chất xơ [32a]: Cân 2g mẫu đã được sấy ở 1050C từ 2 – 3h vào cốc 150ml. Thêm 50ml dung dịch H2SO4 8% và thêm 5ml nước cất đun sôi trong 10 phút. Phần còn lại được rửa gạn với nước nóng nhiều lần (5 lần). Thêm nước cất 1000ml, thêm 9ml dung dịch NaOH 30% và đun sôi 10 phút. Rửa gạn nước nóng nhiều lần, chuyển cặn sang giấy lọc đã biết trọng lượng trước, rửa nhiều lần trên giấy lọc bằng nước nóng. Sấy cặn và giấy lọc ở 1050C trong vòng 5 – 6h. Tính kết quả
X%= − ×100
C B A
A: Khối lượng cặn + giấy lọc (g)
B: Khối lượng giấy lọc (g)
C: Khối lượng mẫu đem phân tích (g)
Phương pháp ủ bã thải tinh bột sắn
Nguyên liệu bã sắn được ủ theo phương pháp ủ phân compost. Nguyên liệu sử dụng được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Nguyên liệu sử dụng trong xử lý bã thải tinh bột sắn
STT Nguyên liệu Hàm lượng
(cho 1 tấn bã sắn) Hàm lượng (cho 50kg bã sắn) 1 Chế phẩm vi sinh vật 200g 10g 2 Rỉ mật 5kg 0,25g 3 Ure 1kg 0,05g 4 Kali 1kg 0,1g 5 Super lân 10kg 0,5g 6 Vôi bột 0,05% 2,5g
Công thức đối chứng: Không bổ sung vi sinh vật.
Công thức thí nghiệm: Có bổ sung vi sinh vật.
Thời gian ủ là 30 ngày. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm pH, nhiệt độ, độ ẩm (theo 10TCN 302 – 97)
Phương pháp trồng cây
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 công thức thí nghiệm và nhắc lại 2 lần.
Cải được trồng trong thùng xốp có kích thước 45ì38ì20cm. Mỗi ô thí nghiệm có 7kg đất và 5g hạt cải.
CTTN 1: Bón 7,75g N: 3,5g P: 1,75g K
CTTN 2: Bón 136g bã thải sau ủ ở công thức đối chứng và NPK tỉ lệ như trên. CTTN 3: Bón 136g bã thải sau ủ ở CTTN và NPK tỉ lệ như trên.
CTTN 4: Bón 136g phân chuồng ủ hoai (phân gà) và NPK tỉ lệ như trên. Cỏc ô thí nghiệm được tưới nước hàng ngày, và theo dõi quá trình sinh trưởng và sự nảy mầm của hạt. Thu hoạch sau 1 tuần gieo hạt. Sau đó xác định trọng lượng tươi của mỗi ô thí nghiệm và tỉ lệ nảy mầm.
Phương pháp xử lý số liệu:
PHẦN IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU