Sản phẩm PCR sau khi được kiểm tra trên gel agarose, sản phẩm tiếp tục được phân tích mức độ đa hình trên gel polyacrylamide.
Các bước chuẩn bị gel polyacrylamide.
Bản gel có kích thước 19 x 50 cm gồm 2 tấm kính, tấm kính ngắn không bám bản gel và tấm kính dài được dùng để gắn bản gel. Rửa sạch hai tấm kính trên 3 lần bằng nước cất 2 lần. Sau đó lau khô bằng giấy lụa mềm, tiếp theo lau lại bằng giấy Kimwipe cho khô và sạch bụi.
Trên tấm kính ngắn sử dụng dung dịch bôi trơn là Rain X thấm trên giấy Kimwipe, chờ từ 15-20 phút cho khô. Trên tấm kính dài sử dụng dung dịch dính gồm 1 ml hỗn hợp với 95% cồn tuyệt đối, 0,5% acetic acid và 2,5 μl bind silance. Để từ 15 - 20 phút cho khô.
Đặt hai tấm spacer vào hai bên mép tấm kính rồi đặt hai tấm kính lên nhau để tạo khuôn đúc gel, khi đó khuôn đúc có độ dày đúng bằng độ dày của thanh spacer.
Tiến hành đổ gel
- Dùng ống đong lấy 55 ml polyacrylamide (5 %), bổ sung thêm 55 μl TEMED, và 165 μl APS 10%, trộn đều.
- Dùng xylanh 140cc hút và bơm từ từ vào khoảng trống giữa hai tấm kính qua một lỗ ở đáy của hệ thống của bản gel.
- Quan sát khi gel chảy ra mép ngoài của tấm kính ngắn, tiến hành lắp lược vào bản gel, chờ từ 2 - 3 giờ cho gel đông lại. Trong trường hợp giữ gel qua đêm ở nhiệt độ phòng cần bịt đầu có lược bằng màng plastic.
Tiến hành điện di
- Sau khi gel đông, lắp bản gel vào hệ thống chạy điện di. Cho chạy thông gel trước khi tra mẫu trong 20 - 30 phút ở công suất 75W trong dung dịch đệm 0,5xTBE.
- Loading gồm: 50 mg Bromophenol blue; 50 mg Xylene cyanlo FF; 90 ml Formamide (95 %), 0,5 ml NaCl (5 M), thêm nước cất vừa đủ 100 ml.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Tra mẫu: Sản phẩm chạy SSR thu được bổ sung thêm loading theo tỷ lệ 2 mẫu: 1 loading rồi trộn đều. Biến tính ở 940C trong từ 8 đến 10 phút rồi cho ngay vào khay đá. Lấy 3,5 μl hỗn hợp đã biến tính tra lần lượt vào các giếng. Thường tra marker 100 đầu tiên hoặc cuối cùng với một lượng khoảng 3 μl ( nồng độ 50 ng/ μl). Để tăng hiệu quả sử dụng cả gel, có thể tra mẫu ở nhiều lược, mỗi bản gel có thể tra từ 2 - 3 lược.
- Công suất chạy gel là 75W, sau 1 - 2 giờ tắt máy, tháo bản gel ra khỏi máy, tách bản kính không dính ra rồi tiến hành nhuộm bạc.
Chuẩn bị dung dịch nhuộm
- Dung dịch cố định (1 lít), bao gồm 250 ml CH3COOH, thêm nước cất cho đủ một lít, dung dịch này dùng được 2 lần.
- Dung dịch nhuộm (1 lít), bao gồm 1 gam AgNO3, 1,5 ml HCHO, thêm nước cất vừa đủ 1 lít, dung dịch dùng được hai lần.
- Dung dịch hiện (1 lít), bao gồm 30 gam sodium cacbonat, thêm vào 1,5 ml HCHO, thêm nước cất vừa đủ 1 lít. Giữ dung dịch ở nhiệt độ lạnh (40C) trong tủ lạnh, dung dịch hiện chỉ dùng một lần và dung dịch bị mật hoạt tính bởi áng sáng và nhiệt độ.
Tiến hành nhuộm bản gel
- Sau khi tách bản gel, đưa gel vào dung dịch cố định đặt lên máy và lắc đến khi không còn thấy các vạch màu nữa, khoảng 30 phút.
- Rửa bản gel 2 lần bằng nước cất, mỗi lần 3 phút
- Nhuộm gel trong dung dịch nhuộm ít nhất trong 30 phút trên máy lắc. - Rửa bản gel đã nhuộm thật nhanh bằng nước cất (không quá 10 giây). - Cho bản gel đã rửa vào dung dịch hiện được làm lạnh sẵn ở 40C. Đặt lên máy lắc từ 5 đến 10 phút, cho đến khi thấy nổi rõ các băng điện di.
- Cố định gel bằng dung dịch cố định trong 3 - 5 phút, kết thúc phản ứng nhuộm.
- Rửa lại bản gel bằng nước cất và để khô ở nhiệt độ phòng, tiến hành chụp ảnh bản gel.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.4. Phương pháp phân tích số liệu SSR
Để nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền người ta thường dựa vào ba hệ số cơ bản: Hệ số Nei và Li (1979), hệ số Jaccard (1908), hệ số SM (Sokal và Michener, 1958). Để phân tích các nhóm và so sánh các ma trận tương đồng với nhau, người ta dùng một số phương pháp ma trận khác nhau UPGMA (Sokal và Michener, 1958), ma trận giống nhau WPGMA (Sneath và Sokal, 1973), liên kết đơn (Lance và Williams, 1976) và liên kết hoàn toàn (Lance và Williams, 1976). Việc chọn sử dụng phương pháp nào là tuỳ thuộc vào từng đối tượng và mục đích nghiên cứu. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sử dụng hệ số tương đồng di truyền Jaccard và phương pháp tính UPGMA cho nghiên cứu đa dạng di truyền là phù hợp hơn cả.
Hệ số tương đồng di truyền Jaccard cho ta biết mối tương quan về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích. Trị số Jaccard càng tiến về 0 thì mức độ tương đồng di truyền giữa các mẫu càng thấp và ngược lại, càng tiến về 1 thì mức độ tương đồng di truyền càng cao. Số liệu thu được từ các chỉ thị qua phản ứng PCR kết hợp với điện di được đưa vào xử lý bằng phần mềm NTSYSpc version 2.02 để tính hệ số tương đồng di truyền và xây dựng biểu đồ quan hệ di truyền giữa các giống mía.
Các băng ADN được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở các mẫu nghiên cứu theo ADN chuẩn (ADN marker). Nếu một băng ADN (có kích thước cụ thể) xuất hiện ở mẫu i nhưng không xuất hiện ở mẫu j hoặc đồng thời xuất hiện ở cả i và j nhưng không xuất hiện ở các mẫu khác thì băng ADN này gọi là băng đa hình. Ngược lại, nếu băng ADN này xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu thì gọi là băng đơn hình.
Các băng được mã hóa bằng số tự nhiên 0 và 1. Nếu mẫu nào có băng thì ký hiệu là 1, còn không có thì ký hiệu là 0. Các số liệu này được đưa vào xử lý theo chương trình NTSYSpc để tính ma trận tương đồng giữa các đôi mẫu (Rohlf, 1993).
Việc tính toán ma trận tương đồng dựa trên công thức: Jij = a/(n – d)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
d: Số băng ADN không có băng cả hai dòng i và j n: Tổng số băng thu được
Jij: Hệ số tương đồng Jaccard giữa hai dòng i và j
Sau đó các mẫu nghiên cứu được xử lý tiếp trong NTSYS – SIMQUAL để tính hệ số tương đồng di truyền và được biểu hiện trên biểu đồ quan hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu.
2.3.5. Phương pháp phân tích hàm lượng đường
Hàm lượng đường được xác định theo chỉ số CCs (content commercial sugar). Để xác định chỉ số CCs người ta phân tích các chỉ tiêu chất lượng sau:
Độ Brixmía là % đường tổng số có trong nước mía. Mẫu mía sau thu hoạch được đem nghiền để thu lấy nước. Nước mía được loại bỏ hết cám mía. Sau đó, tiến hành đo trên máy đo điện tử tự động. Kết quả độ Brix được tính theo công thức:
Brixmía = Bxcc [1-(5 + 100)]
Trong đó: Bxcc là chỉ số đo được trên máy; (5 + F/100) là chỉ số tra trong bảng Xác định hệ số Pol (hệ số phân cực): cân 26 g nước mía đã đo độ Brix cho vào bình định mức 100 ml +1 ml Axetat chì kiềm tính ở nhiệt độ 52,50
C, lắc đều rồi lọc qua giấy lọc ta thu được nước mía trong. Cho vào ống phân cực rồi tiến hành đo hệ số Pol trên máy đo điện tử tự động. Kết quả hệ số Pol xác định theo công thức:
Polmía = Polcc [1-(5+F/100)].
Trong đó Polcc là số đo được trên máy, (5 + F/100) hệ số tra bảng Sau khi biết các chỉ số Brix, hệ số Pol ta tính hệ số CCs theo công thức CCs = 3/2 Polmía – 1/2Brix
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn