Phương pháp PCR với các mồi SSR được thực hiện trên máy PCR PTC – 100 (MJ Research Inc, Mỹ), với tổng thể tích là 15 l/mẫu gồm những thành phần được nêu ở bảng 4. Bảng 6: Thành phần phản ứng SSR - PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O 9,8 µl 2 dNTP (1 mM) 2,0 µl 3 Đệm 10× PCR + MgCl2 (25 mM) 1,5 µl 4 Mồi xuôi (50 ng/μl) 0,4 µl 5 Mồi ngược (50 ng/μl) 0,4 µl
6 Enzyme Taq polymerase (5 UI/μl) 0,1 µl
7 ADN tổng số (25 ng/µl) 0,8 µl
Tổng 15 µl
Phản ứng được thực hiện theo chương trình 940C trong 5 phút, 35 chu kỳ lặp lại với 3 bước chính: biến tính ADN khuôn 1 phút ở 940C, gắn mồi 30 giây nhiệt độ từ 52-610C theo từng mồi (bảng 2) và kéo dài chuỗi ở 720C trong 1 phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1 %.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Các bước tiến hành:
Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1% - Chuẩn bị sẵn khay và lược.
- Dùng ống đong lấy 40 ml dung dịch đệm TBE cho vào bình tam giác. Cân 0,4 g agarose cho vào bình tam giác chứa dung dịch đệm ở trên.
- Đun hỗn hợp trên khoảng 2 phút trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn trong dung dịch.
- Để dung dịch agarose nguội 60ºC và đổ vào khay điện di đã cài sẵn lược, sau đó chờ khoảng 45 phút cho gel đông lại.
- Đặt khay vào bể điện di, đổ dung dịch đệm 1× TBE ngập gel khoảng 0,5 cm rồi rút lược.
Bước 2: Tra mẫu ADN
- Trộn mẫu ADN cần điện di với dung dịch đệm màu (Loading buffer) theo tỷ lệ 1 thể tích dung dịch đệm + 2 thể tích mẫu ADN.
- Tra mẫu vào các giếng điện di
- Tra ADN chuẩn (marker) để giúp xác định độ dài các băng ADN.
- Điện di với hiệu điện thế 60 – 80 V, ADN sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương của điện trường. Dựa vào vị trí của vạch màu để ngừng quá trình điện di. Bước 3: Nhuộm mẫu
Sau khi điện di xong, lấy bản gel ra và ngâm vào nước có thêm Ethidium bromide ở nồng độ 30 µl/l. Để 20 phút sau đó rửa bản gel bằng cách ngâm trong nước 10 – 15 phút.
Bước 4: Quan sát và chụp ảnh
- Bản gel được xem dưới ánh sáng tử ngoại của máy soi ADN.
- Chụp ảnh bằng hệ thống chụp ảnh CLS (Microdoc Cleaver Scientific LTD, Mỹ).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn