ADN tổng số được tách từ các mẫu lá theo phương pháp của Saghai Maroof và cộng sự (1984) có cải tiến cho phù hợp với việc tách chiết ADN tổng số của lá mía. Tách ADN tổng sốđược tiến hành theo các bước sau :
Bước 1: Nghiền mẫu lá mía trong Nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Bột đã nghiền cho vào ống eppendorf 1,5 ml. Thêm 0,7 ml đệm CTAB đã làm ấm ở 65°C trong 10 phút.
Bước 2: Để các ống trong bể ổn nhiệt ở điều kiện 65°C trong 90 phút, lắc nhẹ nhàng nhưng dứt khoát 15 phút một lần để việc tách có hiệu quả.
Bước 3: Chuyển các ống ở bể ổn nhiệt ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Thêm 0,7 ml dung dịch Chloroform/ Isoamyl alcohol (24: 1), lắc ống nhẹ nhàng 15 phút.
Bước 4: Ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 12 phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 5: Hút lớp trên cùng vào ống eppendorf 1,5 ml mới. Thêm 0,8 ml dung dịch Chloroform/ Isoamyl alcohol (24: 1), lắc ống nhẹ nhàng 15 phút.
Bước 6: Ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 12 phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 7: Dùng pipetman hút lớp trên cùng sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Thêm 1 ml cồn tuyệt đối lạnh và 15 µl muối NaCl 5 M. Sau đó xoay ống nhẹ nhàng vài phút. Để mẫu ở tủ - 20ºC trong 20 phút.
Bước 8: Ly tâm tốc độ 8.000 vòng/ phút trong 7 phút.
Bước 9: Bỏ phần dịch phía trên thu lấy tủa. Hoà tan tủa bằng 0,3 ml TE pH 8,0 và để tủ lạnh 4ºC qua đêm.
Bước 10: Hút dung dịch sang ống eppendorf mới, thêm 15 µl RNase đã được đun cách thủy trong 20 phút, sau đó ủ ở 37°C trong 90 - 120 phút.
Bước 11: Thêm 0,8 ml hỗn hợp Phenol/ Chloroform/ Isoamyl alcohol (25: 24: 1), lắc nhẹ trong 15 phút.
Bước 12: Ly tâm các ống trên với tốc độ 10.000 vòng/ phút trong 12 phút. Bước 13: Hút phần dịch trên sang ống eppendorf 1,5 ml mới sau đó thêm 0,8ml dung dịch Chloroform/ Isoamyl alcohol (24: 1), lắc ống nhẹ nhàng 15 phút.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bước 14: Tiến hành ly tâm ở 10.000 vòng/ phút trong 12 phút.
Bước 15: Hút dịch nổi sang ống mới. Thêm 1 ml cồn tuyệt đối lạnh và 15 µl muối NaCl 5M sau đó lắc nhẹ. Ly tâm 8.000 vòng/ phút trong 7 phút. Bỏ phần dịch nổi phía trên đi, thu tủa và rửa tủa bằng cồn 70 % lạnh.
Bước 16: Thổi khô tủa trong 20 phút ở box cấy. Sau đó hoà tan tủa bằng TE. Giữ mẫu trong tủ 4°C.