đến quá trình nhân sinh khối của các chủng vi khuẩn phân giải lân khó tan
4.3.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến mật độ tế bào vi khuẩn
Ảnh hưởng của chất dinh dưỡng đến vi khuẩn biểu hiện ở khả năng sinh trưởng (mật độ tế bào hữu hiệu trên 1ml dung dịch nuôi cấy là lớn nhất).
0 5 10 15 20 25 30 35
Ban đầu Sau 2 tuần Sau 4 tuần Sau 8 tuần
PGL1.4
PGLRH3
BD7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http//: www.lrc-tnu.edu.vn
Chính vì vậy nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến mật độ tế bào vi khuẩn giúp chúng ta biết được trên môi trường nào vi khuẩn có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt nhất, từ đó xác định được môi trường nhân sinh khối tốt nhất. Thí nghiệm được thực hiện trên 3 môi trường dinh dưỡng khác nhau, kết quả thí nghiệm được trình bày ở Bảng 4.7.
Bảng 4.7: Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến mật độ tế bào vi khuẩn
TT Môi trường dinh dưỡng
Mật độ tế bào hữu hiệu (CFU/ml) Của các chủng vi khuẩn
PGL1.4 PGL RH3 BD7 NTXO2
1 Môi trường 1 10,2 x 108 64,0 x 107 13,4 x 108 11,3 x 108 2 Môi trường 2 22,4 x 108 15,8 x 108 21,6 x 108 18,5 x 108 3 Môi trường 3 88,0 x 107 11,4 x 108 16,7 x 108 12,4 x 108
Các chủng khuẩn được cấy vào 3 môi trường khác nhau, ban đầu chúng đều ở dạng dịch trong và lỏng, sau thời gian nuôi 120 giờ với tốc độ lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 280C. Các dịch khuẩn trở nên đục và đặc sánh. Như vậy trên cả 3 môi trường dinh dưỡng các chủng khuẩn đều có khả năng sinh trưởng và phát triển. Nhưng qua kết quả ở Bảng 4.7 cho thấy có sự khác nhau đáng kể về mật độ tế bào của các chủng khi được nuôi ở các môi trường khác nhau. Như chủng PGL RH3 mật độ tế bào đạt cực đại ở môi trường 2 là 15,8 x 108 CFU/ml, nhưng mật độ ở môi trường 1 chúng chỉ đạt 64,0 x 107
CFU/ml. Chủng PGL1.4 cũng phát triển tốt nhất trên môi trường 2 mật độ đạt cực đại là 22,4 x 108 CFU/ml, trong khi đó ở môi trường 3 chủng này chỉ đạt mật độ là 88,0 x 107 CFU/ml. Chủng BD7 và NTXO2 thì phát triển tốt trên cả 3 môi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http//: www.lrc-tnu.edu.vn
trường. Sự chênh lệch về mật độ tế bào chủng BD7 trên 3 môi trường là không đáng kể, nhưng mật độ tế bào đạt cực đại vẫn trên môi trường 2. Như vậy môi trường 2 là môi trường thích hợp nhất cho cả 4 chủng PGL1.4, PGLRH3, BD7 và NTXO2. được thể hiện rõ ở Hình 4.10.
CFU/ml
Hình 4.10: Biểu đồ ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến mật độ tế bào
vi khuẩn
4.3.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến mật độ tế bào vi khuẩn
Tốc độ phát triển của các loài vi khuẩn là khác nhau theo thời gian, có loài phát triển rất nhanh ở thời gian đầu và chậm lại ở thời gian sau, nhưng cũng có loài phát triển chậm ở thời gian đầu và tăng tốc rất nhanh ở thời gian sau. Vì vậy nghiên cứu thời gian đạt mật độ tế bào hữu hiệu của các chủng vi khuẩn là cần thiết, để thuận lợi cho việc nhân sinh khối vi khuẩn sản xuất chế phẩm. Thí nghiệm về ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến mật độ tế bào vi khuẩn được thực hiện trên 5 khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau, kết quả thí nghiệm được trình bày ở Bảng 4.8 và thể hiện rõ hơn qua Hình 4.11.
0 500000000 1000000000 1500000000 2000000000 2500000000
M«i tr-êng 1 M«i tr-êng 2 M«i tr-êng 3
PGL1.4 PGL RH3
BD7 NTXO2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http//: www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 4.8: Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến mật độ tế bào vi khuẩn
TT Thời gian nuôi cấy
Mật độ tế bào hữu hiệu (CFU/ml) Của các chủng vi khuẩn PGL1.4 PGL RH3 BD7 NTXO2 1 Sau 48 giờ 85 x 106 97 x 106 100,3 x 106 92,2 x 106 2 Sau 72 giờ 37 x 107 14 x 107 98 x 107 85 x 107 3 Sau 96 giờ 44 x 108 8 x 108 60 x 108 72 x 108 4 Sau 120 giờ 24 x 108 58 x 108 28,5 x 108 24,6 x 108 5 Sau 144 giờ 67 x 107 72 x 107 98 x 107 92 x 107
Với các thời gian nuôi cấy các chủng vi khuẩn khác nhau thì mật độ tế bào hữu hiệu đạt được là khác nhau. Ở cả 4 chủng PGL1.4, PGLRH3, BD7 và NTXO2 đều theo quy luật thời gian tăng thì mật độ tế bào hữu hiệu tăng, đạt cực đại ở thời gian nhất định rồi giảm dần. Như trong 2 ngày đầu (48 giờ) nuôi cấy mật độ tế bào vi khuẩn có trong 1ml dung dịch ở cả 4 chủng đều đạt thấp, chỉ từ 85 - 100,3 x 106
CFU/ml. Sau đó chủng PGL1.4, chủng BD7 và chủng NTXO2 tăng nhanh và đạt mật độ tế bào hữu hiệu cực đại vào ngày thứ 4 (96 giờ) với mật độ tế bào hữu hiệu đạt được là từ 44- 72 x 108
CFU/ml. Còn chủng PGlRH3 có mật độ tế bào hữu hiệu đạt cực đại là 58 x 108 CFU/ml, sau ngày thứ 5 (120 giờ). Các chủng vi khuẩn sau khi đạt mật độ tế bào hữu hiệu cực đại thì nó bắt đầu giảm dần mật độ tế bào sau 6 ngày (144 giờ). Như chủng PGL1.4 mật độ tế bào hữu hiệu giảm chỉ còn 67x107
CFU/ml. Nguyên nhân của sự giảm mật độ tế bào hữu hiệu trong quá trình nuôi cấy là do trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn chúng đã sản sinh ra các axit hữu cơ. Chính những axit hữu cơ này đã có tác dụng hoà tan phốt phát.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http//: www.lrc-tnu.edu.vn
CFU/ml
Hình 4.11: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến mật độ tế bào
vi khuẩn
4.3.3. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến mật độ tế bào vi sinh vật
Sự phù hợp của tốc độ lắc đến từng chủng vi khuẩn biểu hiện ở khả năng sinh trưởng của chúng (mật độ tế bào hữu hiệu trên 1ml dung dịch nuôi cấy là lớn nhất). Ở mỗi loài vi khuẩn thì sự phù hợp với các tốc độ lắc là khác nhau để đảm bảo được mật độ tế bào hữu hiệu tối ưu. Vì thế cần nghiên cứu ảnh hưởng của các tốc độ lắc khác nhau để tìm ra tốc độ lắc phù hợp với từng chủng vi khuẩn. Thí nghiệm được thực hiện trên 4 chế độ lắc khác nhau: nuôi cấy tĩnh (không lắc), lắc với tốc độ 100 vòng/phút, 150 vòng/phút, 200 vòng/phút, sau 120 giờ tiến hành đếm số lượng tế bào hữu hiệu có trong 1ml dung dịch, kết quả thí nghiệm được trình bày ở Bảng 4.9 và Hình 4.12.
0
Sau 48 giê Sau 72 giê Sau 96 giê Sau 120 giê Sau 144 giê
PGL1.4 PGL RH3 BD7 NTXO2 8000000000 7000000000 6000000000 5000000000 4000000000 3000000000 2000000000 1000000000
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http//: www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 4.9: Ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến mật độ tế bào vi khuẩn
TT Tốc độ lắc
Mật độ tế bào hữu hiệu (CFU/ml) của các chủng vi khuẩn PGL1.4 PGL RH3 BD7 NTXO2 1 Nuôi cấy tĩnh 48 x 106 69 x 106 14,3 x 106 52 x 106 2 Lắc 100 vòng /phút 18 x 107 29 x 106 16 x 107 15 x 107 3 Lắc 150 vòng/phút 25 x 108 10 x 108 33,7 x 108 28,2 x 108 4 Lắc 200 vòng/phút 16,1 x 108 58 x 108 28,5 x 108 42 x 108
Khi nhân sinh khối, tốc độ lắc có ảnh hưởng lớn tới quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, thể hiện ở mật độ tế bào hữu hiệu trong 1ml dung dịch mà chúng đạt được. Trong trường hợp nuôi cấy tĩnh (không lắc) thì mật độ tế bào trên 1ml dung dịch của cả 4 chủng vi khuẩn đạt được là rất thấp, như chủng BD7 chỉ đạt được 14,3 x 106
CFU/ml, trong khi ở tốc độ lắc 150 vòng/phút mật độ tế bào đạt cực đại là 33,7 x 108
CFU/ml. Cũng ở tốc độ lắc 150 vòng/phút chủng vi khuẩn PGL1.4 có số lượng tế bào hữu hiệu là đạt cực đại là 25 x 108
CFU/ml, (gấp khoảng 100 lần so với nuôi cấy tĩnh). Chủng PGLRH3 và chủng NTXO2 có mật độ tế bào hữu hiệu đạt cực đại khi ở tốc độ lắc 200 vòng/phút, với mật độ tế bào thu được là 58 x 108
và 42 x 108 CFU/ml. Như vậy, mỗi chủng vi khuẩn có những tốc độ lắc riêng để chúng sinh trưởng phát triển tốt nhất. Vì thế qua nghiên cứu này giúp cho chúng ta biết được sự thích hợp về tốc độ lắc của từng chủng vi khuẩn để dễ dàng trong việc nhân sinh khối để nuôi cấy chúng. Theo như Hình 4.12, ta thấy tốc độ lắc thích hợp nhất cho cả 4 chủng là 150 vòng/phút hoặc 200 vòng/phút. Đồng thời qua đó khi ta biết được cây Bạch đàn mắc phải bệnh gì mà dùng tốc độ lắc cho phù hợp để sản xuất viên nén bón cho cây, ví dụ: nếu cây Bạch đàn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http//: www.lrc-tnu.edu.vn
mắc phải bệnh nấm C. eucalypti thì khi nuôi cấy các chủng ta nên lắc ở tốc độ 200 vòng/phút. Nếu cây Bạch đàn mắc bệnh nấm F. oxysporium thì khi nuôi cấy các chủng ta nên lắc ở tốc độ 150 vòng/phút.
CFU/ml
Hình 4.12: Biểu đồ ảnh hưởng của tốc độ lắc đến mật độ tế bào vi khuẩn
4.3.4. Ảnh hưởng của độ pH môi trường dinh dưỡng đến mật độ tế bào vi
sinh vật
Độ pH môi trường là một chỉ tiêu hết sức quan trọng để quá trình nhân sinh khối đạt được hiệu quả cao nhất. Thí nghiệm được tiến hành trên nền môi trường dinh dưỡng 3. Điều chỉnh pH của môi trường thành 7 cấp, mỗi cấp
0 Nu«i cÊy tÜnh L¾c 100 vßng /phót L¾c 150 vßng /phót L¾c 200 vßng/phót PGL1.4 PGL RH3 BD7 NTXO2 1000000000 2000000000 3000000000 4000000000 5000000000 6000000000 7000000000
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http//: www.lrc-tnu.edu.vn
cách nhau 0,5; được bắt đầu từ 4,5 đến 7,5 và được tiến hành nghiên cứu với các chủng PGL1.4, PGLRH3, BD7 và NTXO2
Môi trường được khử trùng, cấy một lượng giống như nhau ở các bình có độ pH khác nhau. Nuôi cấy trên máy lắc ở tốc độ 200 vòng/phút, sau 72 giờ tiến hành đếm số lượng tế bào hữu hiệu có trong 1ml dung dịch nuôi cấy bằng phương pháp pha loãng tới hạn. Kết quả về mật độ tế bào ở các trị số pH là rất khác nhau nhưng kết quả của 4 chủng PGL1.4, PGLRH3, BD7 và NTXO2 thì gần như là giống nhau và được trình bày ở Bảng 4.10.
Bảng 4.10: Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến mật độ tế bào
TT Chủng vi sinh vật (CFU/ml) Độ pH môi trường 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 1 PGL1.4 16,8 x 107 17,7 x 107 27,1 x 107 187 x 107 196 x 107 238 x 107 174 x 107 2 PGLRH3 22,8 x 107 23,5 x 107 52,6 x 107 162 x 107 184 x 107 257 x 107 196 x 107 3 BD7 14,2 x 107 18,3 x 107 37,8 x 107 201 x 107 237 x 107 249 x 107 185 x 107 4 NTXO2 12,5 x 107 15,1 x 107 25,4 x 107 148 x 107 212 x 107 233 x 107 162 x 107
Kết quả ở bảng trên cho thấy pH môi trường đã ảnh hưởng rất lớn đến mật độ tế bào có trong 1ml dung dịch nuôi cấy. Mỗi loài vi sinh vật hoạt động trong một phạm vi pH thích hợp, ngoài phạm vi đó sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật bị hạn chế. Đối với cả 4 chủng trên điều là các loài vi khuẩn có biên độ pH tương đối rộng, các chủng này có thể sinh trưởng và phát triển bình thường từ pH môi trường ở 4,5 đến 7,5. Phạm vi pH từ 6,0 - 7,5 chúng đều sinh trưởng và phát triển tốt nhưng thích hợp nhất là ở pH = 7,0. Khi pH = 7,0 mật độ của: PGLRH3 đạt 257x107 (CFU/ml) khi pH hạ xuống 4,5 thì nó phát triển yếu, mật độ chỉ đạt 22,8x107
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http//: www.lrc-tnu.edu.vn
chủng PGL1.4 khi pH = 7 đạt 238 x 107
(CFU/ml) khi pH = 4,5 chỉ có 16,8 x 107 (CFU/ml), trong khi chủng BD7 lại có pH = 7 đạt 249 x 107
(CFU/ml), còn đối với chủng NTXO2 thì pH = 7 đạt 233 x 107
(CFU/ml) và pH = 4,5 có 12,5 x 107(CFU/ml). Quá trình thay đổi mật độ tế bào ở các trị số pH khác nhau được thấy rõ hơn ở Hình 4.13.
CFU/ml
Hình 4.13: Biểu đồ ảnh hưởng của pH môi trường đến mật độ tế bào
Từ hình trên cho thấy mật độ tế bào có trong 1 ml dung dịch ở trị số pH từ 4,5 đến 5,5 tăng rất chậm; mật độ tế bào có trong 1 ml dung dịch nuôi cấy tăng đột biến khi trị số pH môi trường từ 5,5 tăng lên 6,0 và đạt cực đại ở trị số pH là 7,0, sau đó giảm dần. Như vậy đối với các chủng PGL1.4, PGLRH3, BD7 và NTXO2 trị số pH môi trường thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển là từ 6,0 đến 7,0.
4.3.5. Ảnh hưởng của loại giá thể rắn (chất mang) đến mật độ tế bào
0 500000000 1000000000 1500000000 2000000000 2500000000 3000000000 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 §é pH m«i tr-êng PGL1.4 PGLRH3 BD7 NTXO2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http//: www.lrc-tnu.edu.vn
Chế phẩm vi sinh có thể áp dụng được trong sản xuất phải đạt được những tiêu chí cơ bản sau:
- Vi sinh vật tồn tại với mật độ cao và với thời gian bảo quản trong điều kiện bình thường lâu nhất.
- Dễ sản xuất
- Dễ vận chuyển và dễ áp dụng
Trên cơ sở những tiêu chí nêu trên, giá thể rắn có thể đáp ứng được đầy đủ. Nhằm sản xuất chế phẩm phân giải lân có hiệu quả, đề tài đã tiến hành với 3 công thức sau: CT1, CT2 và CT3. Thành phần của các công thức đã được mô tả trong phần phương pháp nghiên cứu. Trộn giá thể, khử trùng, tiêm vào mỗi túi giá thể 12ml dung dịch giống vi khuẩn Burkholderia cenocepacia
được nuôi cấy lắc 150 vòng/phút sau 72 giờ. Định kỳ 4 ngày kiểm tra mật độ tế bào hữu hiệu có trong 1 gam giá thể bằng phương pháp pha loãng tới hạn. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.11.
Bảng 4.11: Mật độ tế bào vi khuẩn Burkholderia cenocepacia
trên các giá thể rắn
Thời gian nuôi cấy (ngày)
Mật độ tế bào vi khuẩn trên các giá thể (CFU/ml)
Công thức 1 Công thức 2 Công thức 3
4 55,0 x 106 0,5 x 106 2,6 x 106
7 112,0 x 106 4,4 x 106 5,5 x 106
11 140,0 x 106 5,2 x 107 13,4 x 106
14 120,0 x 106 2,0 x 107 11,0 x 107
Kết quả ở bảng trên cho thấy: sử dụng đất nghiền, trấu và cát sông làm giá thể để sản xuất chế phẩm vi khuẩn phân giải lân cho kết quả khá tốt. Tuỳ theo công thức, mật độ tế bào vi khuẩn Burkholderia cenocepacia đạt 1,1 x
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http//: www.lrc-tnu.edu.vn
108 CFU/ml ở công thức 3 và đạt 1,4 x 108 CFU/ml sau 14 ngày và 11 ngày nuôi cấy (theo thứ tự). Tiêu chuẩn này phù hợp với tiêu chuẩn phân bón vi sinh Việt Nam. Tuy nhiên tuỳ theo công thức của giá thể mà mật độ tế bào hữu hiệu ở các công thức khác nhau là khác nhau. Công thức 1 cho mật độ tế bào lớn nhất chỉ sau 11 ngày, công thức 3 cho mật độ tế bào gần tương đương với công thức 1 nhưng phải mất 14 ngày, còn công thức thứ 2 sau 14 ngày nuôi cấy cho mật độ tế bào thấp hơn so với 2 công thức kia, nhưng mức độ khác biệt cũng không lớn. Như vậy với 85% đất khô nghiền nhỏ, 10% trấu và 5% cát sông là công thức tốt nhất cho sự phát triển của vi khuẩn trong giá thể cứng. Việc này được thấy rõ hơn ở Hình 4.14.
CFU/ml 0 20000000 40000000 60000000