Để đạt được các mục tiêu nêu trên, đề tài đặt ra các nội dung nghiên cứu sau đây:
3.2.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật phân giải lân khó tan có hiệu lực cao và vi sinh vật đối kháng nấm gây bệnh cho Bạch đàn từ đất
- Phân lập vi sinh vật phân giải lân, vi sinh vật đối kháng nấm gây bệnh cho cây Bạch đàn.
- Tuyển chọn chủng vi sinh vật có hiệu lực phân giải lân cao, vi sinh vật đối kháng nấm gây bệnh cho cây Bạch đàn
- Xác định hàm lượng lân dễ tiêu do vi khuẩn phân giải.
3.2.2. Mô tả và giám định chủng vi sinh vật phân giải lân khó tan có hiệu lực cao và vi sinh vật đối kháng nấm gây bệnh cho Bạch đàn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http//: www.lrc-tnu.edu.vn
3.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng và môi trường đến quá trình nhân sinh khối vi sinh vật phân giải lân khó tan, vi sinh vật đối kháng nấm gây bệnh cho Bạch đàn và xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật phân giải lân
3.2.5. Đánh giá hiệu lực của chế phẩm đối với cây Bạch đàn ở giai đoạn vườn ươm
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật phân giải lân khó tan, vi sinh vật đối kháng nấm gây bệnh cho Bạch đàn
3.3.1.1. Phương pháp phân lập
Chuẩn bị mẫu đất
- Các mẫu đất được lấy từ đất thoái hoá ở Lục Ngạn - Bắc Giang. - Đất được phơi khô ở nơi thoáng mát.
- Mẫu cành Bạch đàn.
- Cành Bạch đàn được nghiền nát.
Chuẩn bị môi trường
Môi trường được pha chế bởi các hoá chất và thành phần của chúng như sau
* Môi trường phân giải lân (môi trường Pikovskaya).
- Glucose: 10,0 gam - Ca3(PO4)2: 5,0 gam - (NH4)2SO4: 0,5 gam - NaCl: 0,2 gam - MgSO4.7H2O: 0,1 gam - KCl: 0,2 gam - Cao nấm men: 0,5 gam - FeSO4.7H2O: vết
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http//: www.lrc-tnu.edu.vn
- Thạch Aga: 18,0 gam
- Nước: 1000 ml
* Môi trường chứa nấm gây bệnh cho cây Bạch đàn (môi trường Kings’ B) các thành phần giống môi trường PGL nhưng có thêm nấm gây bệnh chá y lá Bạch đàn, nấm gây bệnh khô cành ngọn Bạch đàn và không có Ca3(PO4)2.
Môi trường được thanh trùng trong 30 phút, ở 0.8 atm (tương đương 1200C). Môi trường PGL và môi trường chứa nấm gây bệnh cho cây Bạch đàn sau khi được hấp khử trùng được đổ vào các hộp lồng đã được khử trùng một lớp dày từ 2-3 mm.
Phân lập
Dùng phương pháp pha loãng tới hạn để phân lập vi sinh vật phân giải lân khó tan, vi sinh vật đối kháng nấm gây bệnh cho Bạch đàn trong các mẫu đất và cành Bạch đàn:
Cân 10 gam đất và 10 gam cành Bạch đàn được nghiền nát, mỗi thứ pha loãng với 90ml nước vô trùng được tính là 10-1. Tiếp tục pha loãng đến nồng độ 10-5
bằng cách lấy 10ml ở nồng độ 10-1 pha vào 90ml nước vô trùng khác được 10-2
và cứ như vậy đến nồng độ 10-5.Dùng pipét vô trùng lấy 0.01ml dịch mẫu ở các nồng độ từ 10-2
đến 10-5 cho vào đĩa Petri chứa sẵn môi trường phân giải lân (chứa hợp chất lân khó tan Ca3(PO4)2 với tỷ lệ 0.5%) và môi trường chứa nấm gây bệnh Bạch đàn (chứa các mẫu bệnh cây Bạch đàn), sau đó trang đều, băng kín và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 25- 300
C trong khoảng 3- 5 ngày. Môi trường ban đầu có mầu trắng đục và có chứa hợp chất lân khó tan Ca3(PO4)2 nếu là vi khuẩn phân giải lân sẽ phân giải hợp chất Ca3(PO4)2 tạo ra xung quanh nó một vòng trong suốt, còn nếu là vi khuẩn đối kháng nấm gây bệnh cho cho Bạch đàn thì nó hạn chế và làm cho nấm không
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http//: www.lrc-tnu.edu.vn
mọc được trên môi trường và cũng tạo xung quanh nó một vòng trong suốt . Tiến hành đếm mật độ của từng chủng vi khuẩn, sau đó phân lập riêng chúng bằng việc cấy chuyền sang các đĩa Petri khác có chứa môi trường PGL và môi trường mang nấm gây bệnh cây B ạch đàn . Đồng thời quan sát các đặc điểm hình thái của khuẩn lạc như: mầu sắc, hình dạng và dùng thuốc nhuộm bào tử
để quan sát tế bào. Căn cứ vào những đặc điểm đó để ký hiệu các chủng vi khuẩn phân lập được.
3.3.1.2. Phương pháp tuyển chọn các chủng phân giải lân có hiệu lực cao, vi sinh vật đối kháng nấm gây bệnh Bạch đàn
Tạo các chủng vi khuẩn phân giải lân và vi khuẩn đối kháng nấm gây bệnh cây B ạch đàn thuần khiết bằng phương pháp cấy truyền nhiều lần. Cấy các chủng vi khuẩn PGL lên môi trường phân giải lân có chứa Ca3(PO4)2và chủng vi khuẩn đối kháng nấm gây bệnh cho cây Bạch đàn lên môi trường có chứa mẫu bệnh cho cây bạch đàn; đặt các đĩa Petri này trong tủ định ôn có nhiệt độ 25- 300
C trong 5 - 8 ngày. Các chủng vi khuẩn phân giải lân có khả năng phân giải phốt phát khó tan tạo thành vòng không màu trong suốt xung quanh khuẩn lạc và các chủng vi khuẩn đối kháng nấm gây bệnh cho cây
bạch đàn cũng tạo thành vòng không màu trong suốt xung quanh khuẩn lạc. Tuỳ thuộc vào hiệu lực phân giải lân và đối kháng nấm gây bệnh cho c ây bạch đàn của từng chủng vi khuẩn mà chúng tạo thành vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc lớn hay nhỏ. Những chủng vi khuẩn có hiệu lực cao thì đường kính vòng phân giải lớn và ngược lại những chủng có hiệu lực phân giải thấp thì đường kính nhỏ. Để tuyển chọn được các chủng vi khuẩn có hiệu lực phân giải lân cao và chủng vi khuẩn đối kháng nấm gây bệnh cho cây Bạch đàn tốt, ta tiến hành đo đường kính vòng phân giải theo hai chiều
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http//: www.lrc-tnu.edu.vn
vuông góc nhau. Căn cứ vào đường kính của vòng phân giải, phân loại các chủng vi sinh vật với các tiêu chí như sau:
+ Hiệu lực thấp: DTB ≤ 5 mm + Hiệu lực trung bình: 5 < DTB ≤10 + Hiệu lực cao: DTB >10
3.3.1.3. Phương pháp xác định hàm lượng lân dễ tiêu do vi khuẩn phân giải
Các chủng phân giải lân và đối kháng nấm gây bệnh cho cây bạch đã được phân lập thuần khiết đưa vào nuôi trong môi trường Pikovskaya không có Agar. Cấy vi khuẩn vào các bình môi trường đã khử trùng và tiến hành lắc ở 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 28oC, trong 120 giờ. Ly tâm dịch ở 5000 vòng/ phút trong 20 phút để lọc bỏ vi khuẩn phân giải lân và vi khuẩn đối kháng nấm gây bệnh cho cây B ạch đàn lấy dịch trong, so màu ở bước sóng 430 nm. Dùng dung dịch đối chứng là môi trường Pikovskaya không có Agar.
3.3.2. Phương pháp mô tả đặc điểm và giám định các loài vi sinh vật
3.3.2.1. Phương pháp mô tả vi sinh vật
Đặc điểm của các chủng vi sinh vật phân giải lân và chủng vi sinh vật đối kháng nấm gây bệnh cho cây B ạch đàn được mô tả đặc điểm hình thái, màu sắc của khuẩn lạc, hình dạng, kích thước của bào tử được đo và chụp ảnh trên kính hiển vi quang học BX 50 với độ phóng đại 2000 lần.
3.3.2.2. Phương pháp giám định vi sinh vật
Giám định vi sinh vật được dựa trên phân đoạn 16S rADN của vi khuẩn được khuyếch đại trên thiết bị GeneAmp®
PCR System 9700 (PE Applied Biosystem, Mỹ) sử dụng cặp mồi 16S-8F (5’-A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G - 3’) và 16S1510R (5’- G G C T A C C T T G T T A C G A - 3’).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http//: www.lrc-tnu.edu.vn
Chương trình nhiệt được thiết lập với pha biến tính ở 94C trong 2 phút kế tiếp là 35 chu kỳ nhiệt (94C trong 30 giây, 52C trong 30 giây và 72C trong 1 phút). Quá trình khuyếch đại được hoàn tất ở 72C trong 7 phút và sau đó sản phẩm PCR được bảo quản ở 10C. Sản phẩm PCR sau khi khuyếch đại được tinh chế bằng QIAEX II (Qiagen, Đức) theo khuyến cáo của hãng.
Trình tự ADN được đọc bằng phương pháp “dideoxy chain termination” với việc sử dụng kit AmpliTaq (Amersham) theo hướng dẫn của hãng. Máy đọc trình tự, model 377 của hãng Applied Biosystem được sử dụng. Các chuỗi ADN được so sánh với GeneBank thông qua giao diện tìm kiếm BLAST nucleotide-nucleotide đặt tại National Center for Biotechnology Information, Bethesda, Mỹ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Các chuỗi liên quan được chuyển tải về sau đó xử lý bằng phần mềm BioEdit (Hall, 1999) và so sánh bằng ClustalX (Thompson et al, 1997). Cây tiến hoá được hiển thị bằng phần mềm TreeExplorer (Các nguồn này được lấy trong trích dẫn của báo cáo sơ kết đề tài nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ, của Phạm Quang Thu (2008), Viện Khoa học lâm nghiệp Việt Nam, Hà Nội).
3.3.3. Phương pháp nghiên cứu khả năng tập hợp các chủng vi sinh vật trong chế phẩm hỗn hợp
Đánh giá sự thay đổi mật độ tế bào của các chủng vi sinh vật trong các chế phẩm hỗn hợp bằng phương pháp pha loãng tới hạn và cấy trang trên môi trường thích hợp với từng loại vi sinh vật: môi trường Kings’ B đối với vi khuẩn đối kháng nấm gây bệnh và môi trường Pikovskaya đối với vi sinh vật phân giải lân.
3.3.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng và môi trường đến quá trình nhân sinh khối vi sinh vật phân giải lân khó tan,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http//: www.lrc-tnu.edu.vn
vi sinh vật đối kháng nấm gây bệnh và xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật phân giải lân
3.3.4.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật
Thí nghiệm được tiến hành trên ba môi trường dinh dưỡng khác nhau: + Môi trường 1: Môi trường nước khoai tây.
- Khoai tây: 100 gam - Glucose: 5 gam - Sacarose: 5 gam - Nước: 1000 ml
+ Môi trường 2: Môi trường nước chiết khoai tây có thêm một số thành phần nguyên tố khoáng:
- Khoai tây: 100 gam - Glucose: 10 gam
- (NH4)2SO4: 1,0 gam - KH2PO4: 0,5 gam - CaCO3: 0,3 gam - Nước: 1000 ml + Môi trường 3: Môi trường gỉ đường.
- Gỉ đường: 3,0 gam
- Pepton: 5,0 gam
- CaCO3: 1,0 gam
- Nước: 1000 ml
Đối với môi trường nước chiết khoai tây được chuẩn bị như sau: cho 100 gam khoai tây vào nồi đổ 1000ml nước. Đun sôi trong 30 phút, sau đó cho các thành phần khác của môi trường vào và bổ sung cho đủ 1000ml.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http//: www.lrc-tnu.edu.vn
Cho 100ml môi trường trên vào các bình nón có dung tích 250ml, miệng bình nón được nút bằng bông không thấm nước và cuộn giấy ở miệng bình. Môi trường được khử trùng trong thời gian 20 phút ở 1atm (tương đương 1210C), để nguội và cấy vi sinh vật phân giải lân vào (cùng một lượng vi khuẩn). Sau đó cho lên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút, sau 72 giờ tiến hành đo đếm số lượng tế bào vi sinh vật ở các môi trường khác nhau, xác định số lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp pha loãng tới hạn, tương tự với môi trường vi sinh vật đối kháng nấm cho cây Bạch đàn cũng làm như trên , nhưng ở môi trường 2 và 3 có thêm mẫu bệnh (nấm gây bệnh cháy lá và nấm gây bệnh khô cành ngọn) cây Bạch đàn.
Trên cơ sở đó xác định môi trường có số lượng tế bào nhiều nhất tức là môi trường thích hợp nhất cho vi khuẩn sinh trưởng và phát triển.
3.3.4.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến mật độ tế bào vi sinh vật
Phương pháp: cho 100ml môi trường thích hợp nhất được xác định ở thí nghiệm trên (mục 3.3.4.1) vào bình tam giác 250ml, khử trùng trong 20 phút, ở 1atm (tương đương 121oC). Cấy cùng một lượng vi sinh vật và cho lên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút; định kỳ sau 24 giờ lấy ra kiểm tra mật độ tế bào vi sinh vật bằng phương pháp pha loãng tới hạn. Thời gian nuôi cấy tối ưu là thời gian cho mật độ tế bào vi sinh vật có trong 1ml dịch nuôi cấy là lớn nhất.
3.3.4.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến mật độ tế bào vi sinh vật
Phương pháp: cho 100ml môi trường dinh dưỡng thích hợp nhất cho sự phát triển của vi sinh vật vào bình tam giác 250ml. Môi trường được khử trùng như trên (mục 3.3.4.2). Cấy cùng lượng vi sinh vật vào các bình tam giác và tiến hành thí nghiệm lắc ở các tốc độ khác nhau: không lắc (nuôi cấy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http//: www.lrc-tnu.edu.vn
tĩnh), lắc 100 vòng/phút, 150 vòng/phút, 200 vòng/phút; sau 120 giờ lấy ra xác định số lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp pha loãng tới hạn.
3.3.4.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH môi trường dinh dưỡng đến mật độ tế bào vi sinh vật
Phương pháp: cho 100ml môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật vào các bình tam giác 250ml; điều chỉnh PH của môi trường lần lượt ở các cấp trị số: pH=4,5; pH=5; pH=5,5; pH=6; pH=6,5; pH=7; pH=7,5 bằng KOH 10% và HCl 10%. Môi trường được khử trùng như trên (mục 3.3.4.2) và cũng được cấy cùng một lượng vi sinh vật vào các bình có pH môi trường khác nhau. Sau đó cho lên máy lắc với tốc độ thích hợp nhất đã xác định được ở thí nghiệm trên (mục 3.3.4.3) trong 72 giờ lấy ra kiểm tra mật độ tế bào vi sinh vật bằng phương pháp pha loãng tới hạn.
3.3.4.5. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của loại giá thể rắn (chất mang) đến mật độ tế bào vi sinh vật
* Chuẩn bị các công thức thí nghiệm:
Sản xuất chế phẩm vi sinh vật trên nền chất mang được tiến hành với 3 công thức giá thể như sau:
- Công thức 1: + Đất sét nghiền bột: 85% + Trấu nhỏ: 10%
+ Cát sông: 5%
- Công thức 2: + Đất sét nghiền bột: 46% + Phân hữu cơ sấy khô: 46% + Trấu to: 8%
- Công thức 3: + Đất sét nghiền bột: 56% + Phân hữu cơ sấy khô: 40% + Trấu to: 4%
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http//: www.lrc-tnu.edu.vn
Đất và phân hữu cơ được sấy khô ở nhiệt độ 110o
C trong 10- 12 giờ. Các công thức trên được trộn đều và làm ẩm bằng môi trường dinh dưỡng thích hợp nhất cho sự phát triển của vi sinh vật phân giải lân được nghiên cứu ở trên (mục 3.3.4.4).
Môi trường sau khi làm ẩm được đóng gói vào túi PE với khối lượng là 500mg/túi, mỗi công thức giá thể làm từ 5 đến 10 túi, sau đó giá thể được thanh trùng trong 30 phút, ở 1 atm (tương đương 121o
C). * Chuẩn bị dịch vi sinh vật:
Việc nhân sinh khối vi sinh vật được thực hiện trên máy lắc. Cho 200ml môi trường dinh dưỡng thích hợp nhất vào bình tam giác 500ml, điều chỉnh pH môi trường cho phù hợp với sự phát triển của vi sinh vật. Sau đó cấy giống vi sinh vật đã chọn vào, lắc ở tốc độ 200 vòng/phút, trong 72 giờ lấy ra kiểm tra nếu mật độ vi khuẩn đạt khoảng 108
- 109 CFU/1ml thì cấy dịch vi sinh vật vào giá thể với lượng từ 12 - 15 ml/1túi. Sau đó nuôi vi sinh vật trong các túi giá thể ở điều kiện nhiệt độ từ 25 - 30o
C.
* Xác định số lượng tế bào vi sinh vật ở các công thức giá thể bằng