Xuất phát từ ứng dụng của cây thanh hao hoa vàng chống sốt rét cũng như sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học từ một số cây thuốc Việt Nam trong dự án hợp tác Hàn Việt, hoạt tính kháng sốt rét của artemisinin được đánh giá với một số hoạt tính kháng sốt rét của một số hoạt chất từ các cây khác.
Hoạt tính kháng sốt rét của artemisinin được tiến hành theo phương pháp đo sự đồng hoá đồng vị của phóng xạ của ký sinh trùng trong quá trình xâm nhiễm và nhân lên khi nuôi cấy trong môi trường có chứa hồng cầu người theo phương pháp của Desjardin và các cộng sự [16], quy trình được tóm tắt như sau
Ký sinh trùng được nuôi cấy liên tục trong môi trường RPMI 1640 (Gibco) có bổ sung 32 mM NaHCO3 (Gibco), 25 mM HEPES (sigma) và 10% plasma huyết thanh người tup A+ đã khử bổ thể và duy trì ở nhiệt độ 37°C ở độ không khí 5%O2, 5%CO2 và 90%N2. 200 ml dung dịch hồng cầu 1% đã gây nhiễm P.falciparum (0,5-1%) được bổ xung vào phiến nhựa vi lượng 96 lđã chứa sẵn 25 µl dung dịch chất cần thử với nồng độ các chất cần thử được pha loãng khác nhau. Các thuốc kháng sốt rét như quinin, mefloquinin, chloroqin được sử dụng làm thuốc chuẩn làm chứng dương tính. Phiến được ủ
24 giờ trong điều kiện như trên, sau đó 0,5m Ci của [3H (G)] hypoxanthin được thêm bổ xung vào các vi lỗ và phiến được ủ lại trong buồng ẩm ở áp suất và nhiệt độ trên thêm 18 giờ. Thử nghiệm được kết thúc bằng cách lọc bằng giấy lọc, sợi thuỷ tinh trên máy thu giữ tế bào bán tự động. Hoạt tính phóng xạ được đo trên máy đếm nhấp nháy lỏng Wallac Micobeta. Giá trị IC50 được đánh giá thông qua nồng độ ức chế đồng hoá đồng vị phóng xạ tới 50% kí sinh trùng. Mẫu đối chứng không có thuốc được coi là đồng hoá 100%. Kết quả định tính khả năng chống sốt rét của artemisinin cho thấy, chất này có khả năng chống lại các kí sinh trùng sốt rét dòng D6 và dòng W2. Để nghiên cứu một cách định lượng, hoạt tính chống sốt rét được đánh giá chính xác thông qua giá trị IC50. Kết quả nghiên cứu hoạt tính này của một số chất được đưa ra ở bảng
Bảng 3: Giá trị IC50 – hoạt tính chống sốt rét của artemisinin
Tên mẫu Nồng độ ban đầu mg/ml Dòng D6 – Mẫn cảm chloroquin Dòng W2 -Kháng chloroquin Chloroquin 250 2,9 21,8 Mefloquin 250 2,5 2,3 Quinin 250 9,8 57,8 Artemisinin 62,5 2,5 2,3
Kết quả chỉ ra rằng, hợp chất artemisinin có hoạt tính chống sốt rét rất tốt, giá trị IC50 với dòng D6 (mẫn cảm với chloroquin) là 2,5 mg/ml và với dòng W2 (kháng chloroquin) là 2,3 mg/ml với nồng độ ban đầu của thử nghiệm là 62,5 mg/ml. Trong cùng điều kiện nghiên cứu, các hợp chất chloroquin, mefloquin, quinin đều được thử nghiệm với nồng độ ban đầu là 250 mg/ml nhưng kết quả thử nghiệm lại cho thấy artemisinin lại có khả năng chống sốt rét cao nhất.
KẾT LUẬN
1. Đã thu hái và xử lý mẫu cây Artemisia annua.
2. Đã phân lập được hoạt chất artemisinin từ cây Artemisia annua bằng các phương pháp sắc kí khác nhau.
3. Đã kiểm tra độ sạch, các thông số vật lý như điểm chảy, sắc kí bản mỏng... Đã xác định được cấu trúc của artemisinin bằng các phương pháp vật lí hiện đại nhất hiện nay như phổ IR, 1H-NMR, 13C-NMR, DEF 90, DEF 135, COSY.
4. Hợp chất này đã được thử nghiệm hoạt tính sốt rét qua Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên tại Viện Nghiên cứu Sinh học và Công nghệ Sinh học Hàn Quốc. Kết quả cho thấy artemisinin là một trong những hoạt chất có khả năng kháng sốt rét trên người tốt nhất hiện nay.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. K.Paech and M.V.Tracey (1955). Modern methods of plant analysis SPRIGER – VERLAC – BERLIN – HEIDELBERG p. 254 2. J.H.Harborn (1984) Phytochemical methods second edition.
LONDON – NEWYORK pp. 102 – 141
3. Raphael Ikan (1991). Natural products a laboratory guide second edition. LONDON – SEDNEY – TORONTO pp. 168 - 225
4. T.W Graham Solomons (1997). Fundementals of organic chemistry. John Wiley & sons. In pp. 979 – 992
5. Richard J.P Cannell (1998). Natural products isolation human press. TOTOWA, NEW JESEY (USA)
6. Russell J.Molyneux; Steven M.Colegate (1993). Bioactive Natural Products. CRC Press. LONDON – TOKYO pp. 319 – 346
7. Trager, W. and Jensen, J.B (1976). Human malaria parasites in continuous culture. Science 193, pp. 673 – 675
8. Chen, M . , Theander, TG, Christensen, S.B. , Hviild, L. , Zhai, L . and Kharazmi, A (1994). Licochalcone A, a new antimalarial agent, inhibits
in vitro growth of the human malaria parasite Plasmodium falciparum
and protects mice from P. yoclii infection. Antimicrod. Agents chemother, 38 . 1470 – 1475
9. Angerhofer, C . K . , Konig, G .M . , Wright, A.D. ,Sticher, O. ; Milhous, W.K . , Cordell, G.A. , Farnsworth, N.R and Pezzuto, J . M . (1992). Selective screeming of natural products. A resource for the discovery of novel antimalarial compounds.
In: ATTA-UR-RAHMAN (ed). Avandces in natural products chemistry. Chur, Harwood Academic Publisher pp. 311 – 329
10.Peter, W (1980) In: Malaria vol.1 , KREIER, J.P. (ed). New York,
11.Corrado Tringali (2001), Bioactive compounds from natural sources. LONDON and NEW YORK
12.Võ Văn Chi (1999). Từ điển cây thuốc Việt Nam, nhà xuất bản y học
Tr. 818
13.Tạp chí cây thuốc quí, số 16 (5/2004) Tr. 12
14.Yeung – Jin Chang, Seung – Hwan Song; Si – Hyung Park and Soo –
Un Kim (2000). Amorpha - 4, 11-diene synthase of Artemisia annua :
cDNA isolation and bacterial expression of terpene synthase involved
in artemisinin biosynthesis. Archives of Biochemistry.
15.T.Eelco Wallaart, Harro J. Bouwmeester, Jacques Hille, Lucas Poppinga, Niels C.A. Maijers (2001). Amorpha - 4,11 - diene synthase: cloning and functional expression of a key enzyme in the biosynthetic pathway of the novel antimalarial drug artemisinin . Planta 212 pp. 460 – 465
16.Desjadin R.E. , Canfiel C.J. , etal (1979), “Quanlitative assessment of antimalarial activity in vitro by semiautomatic microdilution technique”
Antimicrob Agents Chemother, 16, p 710
17.T.Eelco Wallaart, Niesko Pras, Aaron C. Beekman, and Wim . Quax (2000). Seasonal variation of artemisinin and its biosynthetic precursors in plants of Artemisia annua of different geographical origin: proof for the existence of chemotypes. Planta Medica 66 pp. 57 – 62.
MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU...1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...2
1.1. Giới thiệu về Terpen...2
1.1.1. Định nghĩa terpen và sự phân bố trong tự nhiên...2
1.1.2. Cấu trúc của terpen...3
1.2. Hoạt tính chống sốt rét của các hợp chất thiên nhiên...9
1.3. Giới thiệu về cây ARTEMISIA ANNUA...14
1.3.1. Atemisimin và hoạt tính kháng sốt rét...15
1.3.2. Cơ chế tác dụng của artemisinin...15
1.3.3. Sinh tổng hợp artemisinin trong Artemisia annua...17
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...21
Hoá chất dụng cụ...21
Các phương pháp nghiên cứu...22
2.1. Thu hái mẫu...22
2.2. Phương pháp chiết hồi lưu nóng...22
2.3. Phương pháp chạy sắc kí lỏng chân không...23
2.3.1. Chuẩn bị cột...23
2.3.2. Tiến hành chạy sắc kí lỏng chân không...24
2.4. Phương pháp chạy sắc kí cột...25
2.5. Phương pháp đo điểm chảy...27
2.6. Các phương pháp phổ xác định cấu trúc...27
2.7. Phương pháp thử hoạt tính chống sốt rét của artemisinin...27
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...28
3.1. Thu hái và hàm lượng Artemisia annua ở Việt Nam...28
3.2. Xác định cấu trúc của artemisinin...30
3.2.1. Phổ hồng ngoại...31
3.2.2. Kết quả xác định artemisinin bằng phổ NMR...33
3.3. Hoạt tính chống sốt rét của artemisinin...38
KẾT LUẬN...40
TÀI LIỆU THAM KHẢO...41 PHỤ LỤC
