Để nhận dạng các hợp chất hữu cơ, các nhóm chức được đặc biệt lưu ý do sự tương tác của các nhóm chức khác nhau với các tia bức xạ. Nhờ sự hấp thụ các bức xạ này trong các vùng xác định mà các phương pháp vật lý dùng để xác định cấu trúc phân tử hữu cơ đã xuất hiện. Các phương pháp phổ này nhanh chóng được áp dụng rộng rãi và đã trở thành các phương pháp không thể thiếu trong việc minh chứng các hợp chất hữu cơ. Các phương pháp hiện nay đang được sử dụng nhiều như IR, X-ray, UV, NMR 1 chiều, NMR 2 chiều...
Phương pháp cho kết quả định tính nhanh nhất về sự có mặt của các nhóm chức trong hợp chất hữu cơ cần khảo sát là phương pháp phổ IR, phương
pháp này dựa trên nguyên tắc sự tương tác của hợp chất hữu cơ (cụ thể là các nhóm chức) với các bức xạ trong vùng hồng ngoại. Phân tử có chứa các nhóm chức khi hấp thụ các bức xạ này bị dao động, các dao động này bao gồm hai dao động cơ bản là dao động biến dạng và dao động hoá trị. Dao động biến dạng của các nhóm chức, cụ thể là các liên kết giữa các nguyên tử của nhóm chức làm cho góc liên kết giữa chúng bị thay đổi, sự thay đổi này được thể hiện qua các tín hiệu dao động mà các tín hiệu này được chuyển đổi thành các tín hiệu trên phổ đồ. Trong dao động hoá trị, góc liên kết giữa các phân tử tuy không bị biến đổi nhưng độ dài các liên kết này lại bị thay đổi. Sự thay đổi này cũng dễ dàng được chuyển thành tín hiệu phổ nhờ bộ phận khuyếch đại và chuyển đổi. So với các dao động biến dạng, các dao động hoá trị của một nhóm chức thường xuất hiện ở một vị trí λ nhỏ hơn hay số sóng lớn hơn. Chẳng hạn dao động biến dạng của các liên kết –N-H trong –NH2 thường xuất hiện như là một vạch sắc nét ở vùng 1000-1630 cm-1 . Trong khi đó tín hiệu của dao động hoá trị của các liên kết này lại xuất hiện ở vùng 3400 – 3450 cm-1.
Áp dụng phương pháp này cho hợp chất artemisinin phân lập được từ cây
Artemisia annua Việt Nam, kết quả có các dải dao động ứng với các nhóm sau: Phổ hồng ngoại của artemisinin (hình 9, phụ lục 2) có các đặc trưng sau, dải từ 2800-2979 cm-1 là dao động hoá trị của liên kết C-H, dải 1737 cm-1 của nhóm C = O, các dải từ 1300 cm-1 → 1500 cm-1 của các nhóm = CH2, - CH3 . Các dải từ 1000 → 1200 cm-1 được xem như của các liên kết C - O – C. Ngoài ra các dao động biến dạng của các liên kết C-H cũng xuất hiện từ 700-900 cm-1
Hình 9: Phổ hồng ngoại của artemisinin 3.2.2. Kết quả xác định artemisinin bằng phổ NMR. 3.2.2.1. Phổ H-NMR.1
So với phương pháp phổ IR, phương pháp phổ 1H-NMR thường cho những thông tin chi tiết và chính xác hơn về cấu trúc của các hợp chất cần xác định. Nguyên lý của phương pháp này dựa trên sự tương tác của từ trường ngoài với các proton có trong phân tử các hợp chất hữu cơ. Các tín hiệu này sẽ được chuyển đổi thành các tín hiệu ghi được trên phổ đồ. Trong các phân tử hợp chất hữu cơ, các proton thường gắn với các nguyên tố khác nhau trong các nhóm chức khác nhau, do sự chênh lệch về độ âm điện giữa các nguyên tử này với các nguyên tử hidro mà lớp electron bao quanh proton sẽ bị kéo về các nguyên tử này. Tùy thuộc vào nguyên tố mà proton này liên kết mà lớp electron che phủ proton cũng không giống nhau do đó từ trường để cho các proton này cộng hưởng cũng có giá trị không giống nhau. Giá trị từ trường để cho mỗi proton này cộng hưởng sẽ quyết định vị trí tín hiệu cộng hưởng của proton đó, trên phổ 1H-NMR (độ chuyển dịch hoá học). Các proton tương đương nhau về từ (các proton giống nhau) sẽ cho tín hiệu cộng hưởng ở cùng một vị trí.
Phổ 1H-NMR của artemisinin [hình 10, phụ lục 3]được ghi tại 500 MHz cho thấy các tín hiệu cộng hưởng của các proton khác nhau trong phân tử artemisinin.
Hình 10: Phổ 1H-NMR của artemisinin
Kết quả xác định các proton trong phân tử artemisinin được đưa ra ở bảng sau:
Bảng 1: Các dự liệu cấu trúc phổ 1H-NMR của artemisinin
Proton δ (ppm) J (H2) Proton δ (ppm) J (H2) 3H14 3H13 3H15 H5 H1 2H2 (a,b) H3 (a,b) d: 1,15 d: 1,2 S: 1,4 S: 5,8 m: 1,39 m: 1,78 m: 2,43 4,7 Hz 5,5 Hz 6,2 Hz H7 H8 (a,b) H9 (a,b) H10 H11 Sex 1,78 m(1,98-2,05) m(1,86-1,9) Sext(3,38) Oct(1,2-1,48) 1,8 Hz 4;7,5 Hz 3.2.2.2. Phổ C-NMR13
Phổ 13C-NMR của artemisinin [hình 11, phụ lục 4] xuất hiện 15 tín hiệu ứng với 15 nguyên tử cacbon trong phân tử artemisinin.
Hình 10: Phổ 13C, DEF 90 và DEF 135 NMR của artemisinin
Để xem phân tử artemisinin có bao nhiêu nhóm –CH3, -CH2- và -CH-, chúng tôi tiến hành đo phổ DEF 90 và DEF 135. Dựa và các tín hiệu trong phổ, sự gán phổ được thực hiện dễ dàng hơn. Phổ DEF 90 và DEF 135 cho thấy, phân tử artemisinin có 4 nhóm -CH2- và nhóm –CH= và CH3.
Kết quả gán phổ 13C-NMR của artemisinin được đưa ra ở bảng:
Bảng 2: Các dữ liệu phổ 13C-NMR của artemisinin
Cacbon δ Cacbon δ Cacbon δ
C1 C2 C3 C4 C5 37,5 33,6 35,9 105,3 93,7 C6 C7 C8 C9 C10 79,5 44,9 24,8 23,3 32,9 C11 C12 C13 C14 C15 50,1 172,0 25,1 12,5 19,8
Như vậy, bằng phương pháp phổ hồng ngoại, phổ NMR (1H-NMR và
13C-NMR) chúng tôi thấy rằng các tín hiệu dường như đã trùng khớp với cấu trúc của artemisinin như sau:
O O O O O H3C CH3 H H CH3 Cấu trúc I 3.2.2.3. Các phổ 2 chiều
Để khẳng định chính xác cấu trúc trên, chúng tôi sử dụng thêm phổ hai chiều. Đây là các phương pháp phổ dùng để kiểm tra cấu trúc giải được một cách nhanh nhất. Đặc biệt đối với hoá học các hợp chất thiên nhiên, cấu trúc của các hợp chất phân lập được rất cồng kềnh, sự tương tác giữa các proton với nhau rất phức tạp, các phương pháp phổ NMR một chiều đôi khi không phản ánh một cách chính xác cấu trúc của hợp chất, đặc biệt là cấu trúc lập thể. Ngày nay phương pháp phổ 2 chiều như 1H-1H COSY, 1H-1H NOESY,
1H-13C HMQC, 1H-13C HMBC sẽ cho phép chúng ta xác định chính xác các nhóm –CH=, -CH2-, -CH3 trong phân tử. Ngoài ra, nhờ các phổ này mà chúng ta còn biết các nhóm nào gần nhau nhờ sự tương tác gần nhau của các proton và cacbon 13 trên phổ đồ.
Trở lại với cấu trúc của artemisinin vừa phân lập được, để xem xét các proton và các bon nào thuộc cùng một nhóm, chúng tôi sử dụng phổ HMQC [hình 12, phụ lục 5]
Hình 12: Phổ HMQC của artemisinin
Phổ này thể hiện sự tương tác của các proton gắn trực tiếp với nguyên tử cacbon đang xét. Trên phổ HMQC, các tương tác (C14 – H14), (C15 – H15),
(C9 – H9a,b), (C8 – H8a,b), (C13 – H13)... được thể hiện rất rõ ràng. Nhờ đó chúng tôi khẳng định sự gán phổ 1H-NMR và 13C-NMR là hoàn toàn chính xác. Phổ tương tác C-H qua nhiều liên kết (HMBC [hình 13, phụ lục 6]) cũng cho thấy các tương tác hoàn toàn hợp lý của các C-H qua nhiều hơn một liên kết. Các kết quả cũng khẳng định thêm những kết luận về cấu trúc ở trên.
Hình 13: Phổ HMBC của artemisinin
Cuối cùng để xem xét tương tác giữa H-H cách nhau một liên kết chúng tôi sử dụng thêm phổ 1H-1H-COSY [Hình 14, phụ lục 7]. Các tương tác giữa các proton gần nhau đã cho thấy cấu trúc của artemisinin được khẳng định là cấu trúc (I).
Hình 14: Phổ 1H-1H-COSY của artemisinin
Kết luận: Bằng các phương pháp phổ hiện đại, chúng tôi thấy sản phẩm phân lập được từ cây Artemisia annua là một sesquiterpen c15 với cấu trúc như sau (cấu trúc artemisinin)
O O O O O H3C CH3 H H CH3
3.3. HOẠT TÍNH CHỐNG SỐT RÉT CỦA ARTEMISININ
Xuất phát từ ứng dụng của cây thanh hao hoa vàng chống sốt rét cũng như sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học từ một số cây thuốc Việt Nam trong dự án hợp tác Hàn Việt, hoạt tính kháng sốt rét của artemisinin được đánh giá với một số hoạt tính kháng sốt rét của một số hoạt chất từ các cây khác.
Hoạt tính kháng sốt rét của artemisinin được tiến hành theo phương pháp đo sự đồng hoá đồng vị của phóng xạ của ký sinh trùng trong quá trình xâm nhiễm và nhân lên khi nuôi cấy trong môi trường có chứa hồng cầu người theo phương pháp của Desjardin và các cộng sự [16], quy trình được tóm tắt như sau
Ký sinh trùng được nuôi cấy liên tục trong môi trường RPMI 1640 (Gibco) có bổ sung 32 mM NaHCO3 (Gibco), 25 mM HEPES (sigma) và 10% plasma huyết thanh người tup A+ đã khử bổ thể và duy trì ở nhiệt độ 37°C ở độ không khí 5%O2, 5%CO2 và 90%N2. 200 ml dung dịch hồng cầu 1% đã gây nhiễm P.falciparum (0,5-1%) được bổ xung vào phiến nhựa vi lượng 96 lđã chứa sẵn 25 µl dung dịch chất cần thử với nồng độ các chất cần thử được pha loãng khác nhau. Các thuốc kháng sốt rét như quinin, mefloquinin, chloroqin được sử dụng làm thuốc chuẩn làm chứng dương tính. Phiến được ủ
24 giờ trong điều kiện như trên, sau đó 0,5m Ci của [3H (G)] hypoxanthin được thêm bổ xung vào các vi lỗ và phiến được ủ lại trong buồng ẩm ở áp suất và nhiệt độ trên thêm 18 giờ. Thử nghiệm được kết thúc bằng cách lọc bằng giấy lọc, sợi thuỷ tinh trên máy thu giữ tế bào bán tự động. Hoạt tính phóng xạ được đo trên máy đếm nhấp nháy lỏng Wallac Micobeta. Giá trị IC50 được đánh giá thông qua nồng độ ức chế đồng hoá đồng vị phóng xạ tới 50% kí sinh trùng. Mẫu đối chứng không có thuốc được coi là đồng hoá 100%. Kết quả định tính khả năng chống sốt rét của artemisinin cho thấy, chất này có khả năng chống lại các kí sinh trùng sốt rét dòng D6 và dòng W2. Để nghiên cứu một cách định lượng, hoạt tính chống sốt rét được đánh giá chính xác thông qua giá trị IC50. Kết quả nghiên cứu hoạt tính này của một số chất được đưa ra ở bảng
Bảng 3: Giá trị IC50 – hoạt tính chống sốt rét của artemisinin
Tên mẫu Nồng độ ban đầu mg/ml Dòng D6 – Mẫn cảm chloroquin Dòng W2 -Kháng chloroquin Chloroquin 250 2,9 21,8 Mefloquin 250 2,5 2,3 Quinin 250 9,8 57,8 Artemisinin 62,5 2,5 2,3
Kết quả chỉ ra rằng, hợp chất artemisinin có hoạt tính chống sốt rét rất tốt, giá trị IC50 với dòng D6 (mẫn cảm với chloroquin) là 2,5 mg/ml và với dòng W2 (kháng chloroquin) là 2,3 mg/ml với nồng độ ban đầu của thử nghiệm là 62,5 mg/ml. Trong cùng điều kiện nghiên cứu, các hợp chất chloroquin, mefloquin, quinin đều được thử nghiệm với nồng độ ban đầu là 250 mg/ml nhưng kết quả thử nghiệm lại cho thấy artemisinin lại có khả năng chống sốt rét cao nhất.
KẾT LUẬN
1. Đã thu hái và xử lý mẫu cây Artemisia annua.
2. Đã phân lập được hoạt chất artemisinin từ cây Artemisia annua bằng các phương pháp sắc kí khác nhau.
3. Đã kiểm tra độ sạch, các thông số vật lý như điểm chảy, sắc kí bản mỏng... Đã xác định được cấu trúc của artemisinin bằng các phương pháp vật lí hiện đại nhất hiện nay như phổ IR, 1H-NMR, 13C-NMR, DEF 90, DEF 135, COSY.
4. Hợp chất này đã được thử nghiệm hoạt tính sốt rét qua Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên tại Viện Nghiên cứu Sinh học và Công nghệ Sinh học Hàn Quốc. Kết quả cho thấy artemisinin là một trong những hoạt chất có khả năng kháng sốt rét trên người tốt nhất hiện nay.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. K.Paech and M.V.Tracey (1955). Modern methods of plant analysis SPRIGER – VERLAC – BERLIN – HEIDELBERG p. 254 2. J.H.Harborn (1984) Phytochemical methods second edition.
LONDON – NEWYORK pp. 102 – 141
3. Raphael Ikan (1991). Natural products a laboratory guide second edition. LONDON – SEDNEY – TORONTO pp. 168 - 225
4. T.W Graham Solomons (1997). Fundementals of organic chemistry. John Wiley & sons. In pp. 979 – 992
5. Richard J.P Cannell (1998). Natural products isolation human press. TOTOWA, NEW JESEY (USA)
6. Russell J.Molyneux; Steven M.Colegate (1993). Bioactive Natural Products. CRC Press. LONDON – TOKYO pp. 319 – 346
7. Trager, W. and Jensen, J.B (1976). Human malaria parasites in continuous culture. Science 193, pp. 673 – 675
8. Chen, M . , Theander, TG, Christensen, S.B. , Hviild, L. , Zhai, L . and Kharazmi, A (1994). Licochalcone A, a new antimalarial agent, inhibits
in vitro growth of the human malaria parasite Plasmodium falciparum
and protects mice from P. yoclii infection. Antimicrod. Agents chemother, 38 . 1470 – 1475
9. Angerhofer, C . K . , Konig, G .M . , Wright, A.D. ,Sticher, O. ; Milhous, W.K . , Cordell, G.A. , Farnsworth, N.R and Pezzuto, J . M . (1992). Selective screeming of natural products. A resource for the discovery of novel antimalarial compounds.
In: ATTA-UR-RAHMAN (ed). Avandces in natural products chemistry. Chur, Harwood Academic Publisher pp. 311 – 329
10.Peter, W (1980) In: Malaria vol.1 , KREIER, J.P. (ed). New York,
11.Corrado Tringali (2001), Bioactive compounds from natural sources. LONDON and NEW YORK
12.Võ Văn Chi (1999). Từ điển cây thuốc Việt Nam, nhà xuất bản y học
Tr. 818
13.Tạp chí cây thuốc quí, số 16 (5/2004) Tr. 12
14.Yeung – Jin Chang, Seung – Hwan Song; Si – Hyung Park and Soo – Un Kim (2000). Amorpha - 4, 11-diene synthase of Artemisia annua : cDNA isolation and bacterial expression of terpene synthase involved in artemisinin biosynthesis. Archives of Biochemistry.
15.T.Eelco Wallaart, Harro J. Bouwmeester, Jacques Hille, Lucas Poppinga, Niels C.A. Maijers (2001). Amorpha - 4,11 - diene synthase: cloning and functional expression of a key enzyme in the biosynthetic pathway of the novel antimalarial drug artemisinin . Planta 212 pp. 460 – 465
16.Desjadin R.E. , Canfiel C.J. , etal (1979), “Quanlitative assessment of antimalarial activity in vitro by semiautomatic microdilution technique”
Antimicrob Agents Chemother, 16, p 710
17.T.Eelco Wallaart, Niesko Pras, Aaron C. Beekman, and Wim . Quax (2000). Seasonal variation of artemisinin and its biosynthetic precursors in plants of Artemisia annua of different geographical origin: proof for the existence of chemotypes. Planta Medica 66 pp. 57 – 62.
MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU...1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...2
1.1. Giới thiệu về Terpen...2
1.1.1. Định nghĩa terpen và sự phân bố trong tự nhiên...2
1.1.2. Cấu trúc của terpen...3
1.2. Hoạt tính chống sốt rét của các hợp chất thiên nhiên...9
1.3. Giới thiệu về cây ARTEMISIA ANNUA...14
1.3.1. Atemisimin và hoạt tính kháng sốt rét...15
1.3.2. Cơ chế tác dụng của artemisinin...15
1.3.3. Sinh tổng hợp artemisinin trong Artemisia annua...17
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...21
Hoá chất dụng cụ...21
Các phương pháp nghiên cứu...22
2.1. Thu hái mẫu...22
2.2. Phương pháp chiết hồi lưu nóng...22
2.3. Phương pháp chạy sắc kí lỏng chân không...23
2.3.1. Chuẩn bị cột...23
2.3.2. Tiến hành chạy sắc kí lỏng chân không...24
2.4. Phương pháp chạy sắc kí cột...25
2.5. Phương pháp đo điểm chảy...27
2.6. Các phương pháp phổ xác định cấu trúc...27
2.7. Phương pháp thử hoạt tính chống sốt rét của artemisinin...27
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...28
3.1. Thu hái và hàm lượng Artemisia annua ở Việt Nam...28
3.2. Xác định cấu trúc của artemisinin...30
3.2.1. Phổ hồng ngoại...31
3.2.2. Kết quả xác định artemisinin bằng phổ NMR...33
3.3. Hoạt tính chống sốt rét của artemisinin...38
KẾT LUẬN...40
TÀI LIỆU THAM KHẢO...41 PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 2 PHỤ LỤC 3 PHỤ LỤC 4 PHỤ LỤC 5 PHỤ LỤC 6 PHỤ LỤC 7 PHỤ LỤC 8 PHỤ LỤC 9