3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2. Các phương pháp nghiên cứu
- Kiểm tra mật độ vi sinh vật theo phương pháp Koch
- Xác định các điều kiện sinh trưởng, phát triển của VSV theo phương pháp VSV thông dụng
- Xác định định tính hoạt tính CMC- aza (Williams, 1983): Sinh khối các chủng vi sinh vật sau khi nuôi cấy 48h được li tâm lắng gạn bỏ phần cặn lắng và nhỏ 1ml vào các lỗ thạch đã được chuẩn bị sẵn trên các đĩa Petri chứa môi trường CMC đặc (CMC: 1g; Thạch: 12g; H2O: 1.000 ml). Lưu giữ đĩa thạch trong tủ ấm 24 h, sau đó lấy ra và tráng bề mặt thạch bằng dung dịch lugol.
Hoạt tính sinh học được xác định bằng kích thước vòng phân giải, vòng tròn trong suốt bao quanh lỗ thạch ((hiệu số giữa đường kính vòng tròn trong suốt (D) và đường kính lỗ thạch (d).
- Xác định khả năng phân giải lignocellulose: bằng tỷ lệ giảm trọng lượng của mẫu thí nghiệm so với mẫu đối chứng.
Phương pháp tiến hành:
Bước 1: Cân chính xác 40 g rơm đã được cắt nhỏ, sấy khô cho vào bình tam giác 1000 ml.
Bước 2: Bổ sung vào mỗi bình 100ml dịch nuôi cấy lắc vi sinh vật.
Bước 3: Đặt bình rơm trong tủ ấm 37oC trong 7 ngày. Sau đó rửa sạch, loại bỏ tạp chất hòa tan và sấy khô phần còn lại chưa phân huỷ được. Tỷ lệ giảm trọng lượng của mẫu thí nghiệm so với mẫu đối chứng được tính theo công thức:
29 X(%)= (mo-mt)/mo. 100
Trong đó:
X: % độ giảm trọng lượng của mẫu thí nghiệm mt: Trọng lượng khô còn lại của mẫu thí nghiệm mo: Trọng lượng khô còn lại của mẫu đối chứng - Phương pháp cấy vạch: dùng để
ộ .
- Phương pháp đánh giá khả năng sống sót của các chủng VSV lựa chọn trên nền chất mang dạng bột là cám gạo: Các chủng VSV lựa chọn được nhiễm vào chất mang được khử trùng với tỷ lệ là 1:4. Các dụng cụ sử dụng, đóng gói chất mang và thao tác nhiễm VSV vào chất mang diễn ra trong điều kiện vô trùng. Sau khi nhiễm VSV vào chất mang, để chế phẩm ở điều kiện phòng trong 7 ngày thì kiểm tra hoạt tính phân giải cellulose của các chủng VSV.
Phương pháp xác định khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh thực vật: 10TCN - 714-2006.
- Phương pháp Salkowsky cải tiến xác định
khả năng sinh tổng hợp IAA thô: Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung 0,1% Triptophan. Sau thời gian nuôi cấy, ly tâm, thu được dịch trong. Cho 2 ml dịch trong vào ống nghiệm chứa 8 ml thuốc thử Salkowsky cải tiến. Lắc đều, để yên trong 20 phút, sau đó so màu trên máy với bước sóng 530nm. Hàm lượng IAA tạo ra trong môi trường được tính toán trên cơ sở đồ thị IAA chuẩn.
Thuốc thử Salkowsky cải tiến: FeCl3 0,5M 15ml; H2SO4 98% 300 ml; Nước cất 500 ml.
- Phương pháp xác định khả năng phân giải phốt phát khó tan được xác định bằng đo vòng phân giải Ca3(P04)2 trên môi trường đặc; đó là vòng tròn trong suốt bao quanh khuẩn lạc (đối với trường hợp cấy điểm) hoặc lỗ thạch (đối với trường hợp khoan lỗ thạch), nơi mà vi sinh vật phân giải Ca3(P04)2.
30
- Đánh giá khả năng cố định Nitơ: bằng phương pháp đo khả năng khử axetylen (hàm lượng etylen hình thành) trên máy sắc ký khí.
- Phương pháp ủ compost
Chuẩn bị nguyên liệu:
+ Nguyên liệu hữu cơ: 10 kg/loại/lần ủ. + Chế phẩm vi sinh vật phân huỷ cellulose.
+ Chất phụ gia (vôi bột, đạm, lân super, kali clorua). Xử lý thô:
Nguyên liệu sau khi thu gom được xử lý thô như sau:
+ Than bùn: nghiền nhỏ, loại bỏ tạp chất (thủy tinh, mảnh vụn kim loại,...); dùng vôi bột điều chỉnh pH đạt 6 - 7; điều chỉnh độ ẩm đạt 40 – 45%
+ Rơm rạ: cắt ngắn khoảng 10 – 12 cm; ngâm qua nước vôi trong để pH đạt 6 – 7, độ ẩm 40 – 45%.
+ Phân chuồng: loại bỏ tạp chất (nilon, mạnh vụn,...); điều chỉnh để nguyên liệu có độ ẩm 50 – 60% bằng cách: nếu phân ướt quá thì trộn thêm chất độn chuồng, nếu khô thì tưới nước.
+ Thân lá lạc: cắt ngắn khoảng 10 – 12 cm; ngâm qua nước vôi trong để pH đạt 6 – 7, độ ẩm 40 – 45%.
+ Thân lá đậu tương: cắt ngắn khoảng 10 – 12 cm; ngâm qua nước vôi trong để pH đạt 6 – 7, độ ẩm 40 – 45%.
Tiến hành ủ compost: nguyên liệu sau khi xử lý thô (10 kg) được trộn đều với N:P:K theo tỷ lệ 1:1:1 và 2% chế phẩm vi sinh phân giải cellulose. Hỗn hợp này được ủ trong các thùng ủ bằng nhựa plastic có nắp đậy. Sau ủ 7 ngày tiến hành đảo trộn, đảo từ trong ra ngoài và từ trên xuống dưới để trộn đều nguyên liệu và tránh nhiệt độ lên quá cao. Sau đó đậy nắp lại.
Mỗi thùng ủ được đặt 1 nhiệt kế, và ghi nhiệt độ đống ủ hàng ngày trong khoảng thời gian từ 9 – 10 giờ sáng.
Trong quá trình ủ theo dõi độ ẩm của đống ủ. Nếu đống ủ khô quá thì có thể bổ sung nước bằng cách tưới lên bề mặt đống ủ.
31
* Trong quá trình ủ theo dõi nhiệt độ, độ thông khí, biến động quần thể vi sinh vật trong đống ủ, trong đó
+ Mật độ vi sinh vật tổng số được kiểm tra trên môi trường Thạch thịt - pepton
+ Mật độ nấm tổng số được kiểm tra trên môi trường Czapeck
+ Mật độ xạ khuẩn phân giải cellulose được kiểm tra trên môi trường Gauze
+ Mật độ vi khuẩn phân giải cellulose được kiểm tra trên môi trường Hans * Đánh giá sau quá trình ủ: thời gian ủ, đánh giá cảm quan sản phẩm sau ủ (màu sắc, mùi sản phẩm..), hàm lượng NPK dễ tiêu, pH, độ chín của phân ủ, hàm lượng mùn.
- Bố trí thí nghiệm trong ủ compost trong điều kiện nhà lưới:
Thí nghiệm được bố trí với 5 nguồn nguyên liệu hữu cơ gồm: rơm rạ, than bùn, phân chuồng, thân lá lạc, thân lá đậu tương.
Thí nghiệm ủ compost với mỗi nguồn nguyên liệu hữu cơ được bố trí làm 2 công thức, 3 lần nhắc lại, gồm:
ĐC: công thức đối chứng: gồm nguyên liệu hữu cơ
TN: công thức thí nghiệm: gồm nguyên liệu hữu cơ + 2% chế phẩm vi sinh vật (dạng dịch hoặc dạng bột) + N:P:K theo tỷ lệ 1:1:1
32
Bảng 6: Các công thức thí nghiệm
TT Nguyên liệu hữu
cơ Lần nhắc Công thức thí nghiệm Đối chứng Thí nghiệm 1 Rơm rạ 1 ĐC 1.1 TN 1.1 2 ĐC 1.2 TN 1.2 3 ĐC 1.3 TN 1.3 2 Than bùn 1 ĐC 2.1 TN 2.1 2 ĐC 2.2 TN 2.2 3 ĐC 2.3 TN 2.3 3 Phân chuồng 1 ĐC 3.1 TN 3.1 2 ĐC 3.2 TN 3.2 3 ĐC 3.3 TN 3.3 4 Thân, lá lạc 1 ĐC 4.1 TN 4.1 2 ĐC 4.2 TN 4.2 3 ĐC 4.3 TN 4.3 5 Thân, lá đậu tương 1 ĐC 5.1 TN 5.1 2 ĐC 5.2 TN 5.2 3 ĐC 5.3 TN 5.3
- Phương pháp Plant test (Subrao - Indian, 1980): để đánh giá độ chín của phân ủ. Đánh giá độ chín của phân ủ bằng khả năng nẩy mầm của hạt cải trên cơ chất là các mẫu rơm đã ủ sau 28 ngày. Mẫu phân ủ được lấy từ đống ủ, nghiền nhỏ và trộn với đất. Thí nghiệm được chia làm các công thức: CT1 (90% đất + 10% phân ủ được nghiền nhỏ); CT2: đối chứng (đất bình thường). Mỗi chậu gieo 100 hạt cải. Tiến hành xác định số hạt nảy mầm/tổng số hạt đã gieo trên các công thức thí nghiệm.
- Phương pháp xác định độ chín (hoai mục) của phân ủ: được xác định bằng phương pháp đo nhiệt độ của túi phân ủ.
33
Cách tiến hành như sau: Sử dụng nhiệt kế có mức đo nhiệt độ từ 00C - 1000C, cắm sâu khoảng 10 - 12 cm vào trong túi phân ủ có trọng lượng không nhỏ hơn 2 kg. Sau 15 phút đọc nhiệt độ. Tiến hành theo dõi và ghi chép sự thay đổi nhiệt độ trong 3 ngày liên tiếp, mỗi ngày đo 1 lần (vào 9-10 giờ), thí nghiệm lặp lại 3 lần. Phân ủ bảo đảm độ chín (hoai mục) khi nhiệt độ của túi cơ chất không thay đổi trong suốt thời gian theo dõi.
Thí nghiệm được bố trí như sau: Với mỗi sản phẩm ủ compost cả sản phẩm thí nghiệm và đối chứng, đóng túi có trọng lượng 2 kg/túi. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
- Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel 2003.
34
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN