Nghiên cứu về môi trường nuôi cấy giữ một vị trí quan trọng trong lịch sử phát triển nuôi cấy mô và tế bào. Cơ sở cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là việc xem xét các thành phần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây. Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với các hoocmon sinh trưởng nội sinh. Phân chia tế bào, phân hóa và biệt hóa được điều khiển bằng sự tác động tương hỗ giữa các loại hoocmon sinh trưởng ngoại sinh và nội sinh. Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô. Những nghiên cứu của Skoog cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao kớch thớch cho sự hình thành rễ, tỷ lệ này sẽ kích thích quá trình phát sinh chồi. Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận lợi cho phát triển mô sẹo (callus) [2], [8], [9], [20].
Nghiên cứu và đánh giá khả năng tạo callus thực hiện trên 5 loại môi trường khác nhau:
(C1): MS + 3% Sucrose + 0,8% Agarose + 1mg/l NAA + 0,2 mg/l BAP (C2): MS + 3% Sucrose + 0,8% Agarose + 1mg/l 2,4D + 0,2 mg/l BAP (C3): MS + 3% Sucrose + 0,8% Agarose + 2 mg/l 2,4D
(C4): MS + 3% Sucrose + 0,8% Agarose + 0,1mg/l αNAA + 0,2mg/l BAP + 2mg/l 2,4D (C5): MS + 3% Sucrose + 0,8% Agarose + 0,1mg/l αNAA + 0,2mg/l BAP + 2,5 mg/l 2,4D
Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương
Bảng 3.2: Kết quả nghiên cứu môi trường tạo callus
Dòng Tổng số mẫu
cấy
Tỷ lệ mẫu tạo callus trên môi trường
Môi trường C1 Môi trường C2 Môi trường C3 Môi trường C4 Môi trường C5 Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) N18 150 57 38,00 65 43,33 97 64,67 113 75,33 95 63,33 N46 150 74 49,33 60 40,00 91 60,67 120 80,0 90 60,00 N91 150 70 46,67 84 56,00 115 76,67 135 90,0 105 70,00 NV1 150 62 41,33 68 45,33 85 56,67 80 53,33 108 72,0 Chung 600 263 43,83 277 46,17 388 64,67 448 74,67 398 63,33 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 C1 C2 C3 C4 C5 N18 N46 N91 NV1
Biểu đồ 3.5: Hiệu quả tạo callus trờn cỏc môi trường nuôi cấy của 4 dòng lúa N18, N46, N91 và NV1
Kết quả ở bảng 3.2 và biểu đồ 3.5 cho thấy:
- Trên các môi trường thử nghiệm, cả 4 dòng nghiên cứu đều có khả năng tạo callus. Tỷ lệ callus tạo ra ở các môi trường khác nhau và ở cỏc dũng khác nhau trên cùng loại môi trường là khác nhau.
- Trên môi trường MS có bổ sung 1mg/l NAA và 0,2 mg/l BAP (môi trường C ), tỷ lệ auxin/cytokinin = 1 : 0,2 mô sẹo có tạo ra nhưng tỷ lệ thấp,
Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương
- Ở môi trường C2: MS có bổ sung 1mg/l 2,4D và 0,2 mg/l BAP (so với môi trường C1, NAA được thay bằng 2,4D), tỷ lệ mô sẹo tạo ra cũng không thay đổi nhiều so với môi trường C1, tính chung cho cả 4 dòng là 46,17%.
- Ở môi trường C3: MS có bổ sung 2mg/l 2,4D, thấy rằng: Tỷ lệ tạo mô sẹo tăng hơn hẳn so với công thức môi trường C1 và C2. Có thể thấy hàm lượng cytokinin nội sinh ở hạt lúa là lớn. Tuy nhiên, hình thái mô sẹo tạo ra trên môi trường C3 chưa tốt, sẹo tạo thành nhỏ, không chắc, dạng bở…
- Hiệu quả tạo callus cao nhất trên môi trường C4 (MS có bổ sung 0,1 mg/l αNAA, 0,2 mg/l BAP và 2 mg/l 2,4D) với tỷ lệ mẫu tạo callus của từng dòng là: dòng N18 – 75,33%, dòng N46 – 80%, dòng N91 – 90%, dòng NV1 cũn khỏ thấp 53,33%. Hình thái mô sẹo tạo thành lớn, chắc, màu vàng sỏng… Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh, auxin nội sinh và kết hợp với cytokinin có thể đã cảm ứng tạo mô sẹo và duy trì mô sẹo. Như vậy, trong 5 loại môi trường thử nghiệm thì môi trường C4 là phù hợp nhất đối với cỏc dũng N18, N46 và N91 trong việc tạo callus. Với dòng NV1 môi trường C4 có thể chưa phù hợp, hiệu quả tạo callus thấp và các nghiên cứu thờm đó được tiến hành, sử dụng môi trường C5.
- Ở môi trường C5: Khác với môi trường C4, hàm lượng 2,4D tăng lên 2,5mg/l. Kết quả cho thấy: tỷ lệ mẫu có hình thành mô sẹo ở cỏc dũng N18, N46, N91 giảm, chất lượng sẹo tạo thành không tốt so với môi trường C4. Nhưng ở dòng NV1 tỷ lệ mẫu có hình thành mô sẹo tăng so với tỷ lệ mô sẹo tạo ra khi nuôi cấy trên môi trường C4, từ 53,33% lên 72,0%, hình thái mô sẹo tạo thành cũng tốt hơn. Có thể hàm lượng 2,4D tăng đã làm phá vỡ sự cân bằng giữa auxin và cytokinin, sự dư thừa 2,4D đã dẫn đến ức chế sự hình thành mô sẹo đối với cỏc dũng N18, N46, N91. Tuy nhiên, môi trường có hàm lượng 2,4D tăng là cần thiết để tạo mô sẹo đối với giống NV1.
Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương
Hình 3.5: Callus hình thành từ hạt của dòng N18 sau 2 tuần nuôi cấy
trên môi trường C4
Hình 3.6: Callus hình thành từ hạt của dòng NV1 sau 2 tuần nuôi cấy trên môi
trường C5 Nhận xét:
+ Môi trường C4 (MS + 3% Sucrose + 0,8% Agarose + 0,1 mg/l αNAA + 0,2 mg/l BAP + 2 mg/l 2,4D) là môi trường phù hợp để tạo callus ở các dòng N18, N46 và N91.
+ Môi trường C5 (MS + 3% Sucrose + 0,8% Agarose + 0,1 mg/l αNAA + 0,2 mg/l BAP + 2,5 mg/l 2,4D) là môi trường tạo callus phù hợp đối với dòng NV1.