a) Nghiên cứu môi trường tạo sẹo (Callus)
Tạo calus là bước đầu tiên và cũng là bước quan trọng nhất trong một chu kỳ nuôi cấy mô thực vật nói chung và nuôi cấy mụ lỳa nói riêng. Do đó, việc lựa chọn được môi trường tạo callus phù hợp đóng vai trò quyết định đến việc thành bại của thí nghiệm. Trên cơ sở những nghiên cứu của Shazia Bano và cộng sự (2005)[38], Lê Xuân Đắc (2007)[7], Lã Thị Luyến (2008)[12], Nguyễn Đức Thành [20], chúng tôi tiến hành thí nghiệm trờn cỏc môi trường sau:
(C1): MS + 3% Sucrose + 0,8% Agarose + 1mg/l NAA + 0,2 mg/l BAP (C2): MS + 3% Sucrose + 0,8% Agarose + 1mg/l 2,4D + 0,2 mg/l BAP (C3): MS + 3% Sucrose + 0,8% Agarose + 2 mg/l 2,4D
(C4): MS + 3% Sucrose + 0,8% Agarose + 0,1mg/l αNAA + 0,2mg/l BAP + 2mg/l 2,4D (C5): MS + 3% Sucrose + 0,8% Agarose + 0,1mg/l αNAA + 0,2mg/l BAP + 2,5mg/l 2,4D
Hạt lúa đó tách vỏ sau khi được khử trùng, đặt lên giấy thấm vô trùng, chờ cho khô mẫu, sau đó mẫu được cấy vào trong môi trường tạo mô sẹo với mật độ 10 – 15 hạt/1 bình tam giác 250ml và để vào tối ở nhiệt độ 250C. Một tuần sau
Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương
khi cấy khối mô sẹo đạt kích thước khoảng 1-2 mm thì đưa ra chỗ sáng với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày.
Để đánh giá mức độ phù hợp của môi trường, chúng tôi tiến hành theo dõi tỷ lệ phần trăm mô sẹo được tạo ra.
Số mô sẹo được tạo ra
Tỷ lệ mô sẹo được tạo ra = x 100% Tổng số hạt được cấy vào
Ngoài ra hình thái của mô sẹo tạo thành cũng là một chỉ tiêu để chúng tôi đánh giá sự phù hợp của môi trường.
Sau 3 tuần nuôi cấy, mô sẹo được đem chiếu xạ tia gamma (Co60) với 4 liều chiếu khác nhau: 0,5kr; 1 kr, 1,5kr; 2 kr.
Sau khi chiếu xạ, các mẫu được đặt dưới ánh sáng với cường độ 2000lux, sau 1 tuần các khối mô sẹo được tách ra và cấy chuyển sang môi trường tái sinh chồi.
b) Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi Chúng tôi sử dụng 4 công thức môi trường sau:
(R1): MS + 3% Sucrose + 0,7% Agarose + 0,1 mg/l αNAA + 1 mg/l BAP (R2): MS + 3% Sucrose + 0,7% Agarose + 0,1 mg/l αNAA + 2 mg/l BAP (R3): MS + 3% Sucrose + 0,7% Agarose + 0,1 mg/l αNAA + 3 mg/l BAP (R4): MS + 3% Sucrose + 0,7% Agarose + 0,1 mg/l αNAA + 4 mg/l BAP Để đánh giá sự phù hợp của môi trường tái sinh chồi, chúng tôi tiến hành theo dõi hệ số tạo chồi của các giống.
Số mô sẹo có chồi tạo thành
Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương
Môi trường tái sinh chồi còn được sử dụng để nhân chồi nhằm tăng số lượng cây in vitro, qua đó cũng đánh giá được hệ số nhân chồi của từng giống nghiên cứu.
Tổng số chồi được tạo thành Hệ số nhân chồi =
Tổng số chồi được cấy vào môi trường