Phân tích định tính
Trong phƣơng pháp HPLC, ngƣời ta định tính mẫu bằng cách so sánh thời gian lƣu (tr) của cấu tử phân tích với chất chuẩn. Việc so sánh này chỉ có giá trị khi tiến hành thí nghiệm trên mẫu và chất chuẩn ở các điều kiện hoàn toàn giống nhau cả về pha tĩnh, pha động, nhiệt độ…
So với phƣơng pháp phổ hồng ngoại, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hoặc khối phổ, phƣơng pháp HPLC có vai trò kém quan trọng hơn trong phân tích định tính vì việc đánh giá sự hiện diện của các cấu tử dựa vào thời gian lƣu (tr) có độ chính xác không cao lắm.
Phƣơng pháp HPLC chỉ đƣợc xem là một công cụ đắc lực đƣợc sử dụng để đánh giá sự hiện diện hoặc vắng mặt của các hỗn hợp chứa một số giới hạn các cấu tử có thể đã đƣợc nhận danh trƣớc.
25
Phân tích định lượng
Cơ sở của phƣơng pháp dựa trên giả thiết rằng các biến đổi tín hiệu của detector có quan hệ mật thiết với sự biến đổi nồng độ của các chất đƣợc tách ra bằng sắc ký theo một tƣơng quan tỷ lệ thuận.
- Phương pháp dựa vào chiều cao peak:
Chiều cao peak đƣợc đo bằng cách nối đƣờng nền giữa hai chân của peak bằng một đƣờng thẳng và đo chiều cao của peak từ đƣờng nền này. Chỉ nên sử dụng phƣơng pháp này khi bề rộng của peak mẫu và peak chuẩn hoàn toàn bằng nhau. Điều này chỉ thực hiện đƣợc khi khống chế nghiêm ngặt nhiệt độ cột, tốc độ của pha động, tốc độ bơm mẫu và tránh cho cột không bị quá tải.
- Phương pháp dựa vào diện tích peak
Diện tích peak không phụ thuộc vào độ rộng của peak. Mặt khác diện tích peak rất dễ đƣợc xác định một cách chính xác, nhất là đối với các peak hẹp. Hầu hết các thiết bị sắc ký hiện đại đều có bộ tích phân kế điện tử cho phép xác định chính xác diện tích peak.
Phƣơng pháp 100% diện tích peak: Phƣơng pháp này hầu nhƣ không còn đƣợc sử dụng vì sai số rất lớn (ngoài hàm lƣợng của mẫu khảo sát, tín hiệu của detector còn phụ thuộc vào loại detector và bản chất hoá học của chất nghiên cứu).
Phƣơng pháp chuẩn ngoại: Lập đƣờng chuẩn diện tích peak theo nồng độ của cấu tử cần khảo sát. Chọn điều kiện thích hợp để quan hệ giữa diện tích peak và nồng độ là tuyến tính. Định lƣợng cấu tử cần khảo sát bằng việc xây dựng đƣờng chuẩn hoặc bằng phƣơng pháp bình phƣơng cực tiểu.
Phƣơng pháp chuẩn nội: Thêm vào mẫu một chất chuẩn có nồng độ biết trƣớc đƣợc gọi là chất chuẩn nội. Chất chuẩn nội có thể có tính chất hoá lý rất gần với cấu tử khảo sát hoặc có thể là một cấu tử nào đó có mặt trên sắc ký đồ. Độ chính xác của phƣơng pháp này không phụ thuộc vào độ lặp lại của quá trình bơm mẫu.
26