Là loại hiếu khí bắt buộc hoặc hiếu khí tuỳ tiện. Bacillus subtilis sử dụng oxy hoà tan làm chất nhận điện tử trong quá trình trao đổi chất [1], [11].
17
Cũng giống nhƣ các loài khác trong chi Bacillus, Bacillus subtilis có thể sử dụng nhiều nguồn carbon và nitơ khác nhau. Đây là loại vi khuẩn dễ sinh trƣởng và phát triển rộng. Điều kiện nuôi cấy tối ƣu là pH 6.5 – 7.5, nhiệt độ từ 30 – 45oC.
Đƣờng cong sinh trƣởng vào giai đoạn ổn định ở trong khoảng 18 – 30 giờ.
Hình 1.10. Đƣờng cong sinh trƣởng của Bacillus subtilis [11]. 1.2.5.3 Ứng dụng của Bacillus subtilis
Bacillus subtilis mang lại lợi ích trong nhiều lĩnh vực, bao gồm các ứng dụng công nghiệp. Chúng đƣợc sử dụng để sản xuất enzyme amylase – có tác dụng thuỷ phân tinh bột để sử dụng trong các ngành công nghiệp sản xuất giấy, ngành công nghiệp dệt may. Bacillus subtilis cũng sản xuất các enzyme protease, subtilisin, đƣợc sử dụng trong chất tẩy rửa và các ngành công nghiệp da [39].
Trong ngành y tế, Bacillus subtilis đƣợc dùng để sản xuất nhiều loại thuốc kháng sinh, nhƣ difficidin, oxydifficidin, bacillomyin B, Bacitracin, dùng điều trị nhiễm trùng da do vi khuẩn, ngăn ngừa nhiễm trùng do các vết cắt nhỏ hoặc các vết bỏng.
Trong nông nghiệp, Bacillus subtilis đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc diệt nấm. Vi khuẩn xâm chiếm hệ thống rễ cây, ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh nấm [13]. Chúng đƣợc sử dụng cho các hạt giống nông nghiệp, nhƣ rau, đậu tƣơng, bông, đậu phộng, hạt giống hoa và cây cảnh. Chúng cũng đƣợc sử dụng để sản xuất chất độc tiêu diệt côn trùng, nhƣ tiêu diệt ấu trùng muỗi sốt rét.
18
Trong vài năm gần đây, cũng đã có một số nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilis nhƣ là một loại probiotic hỗ trợ sức khoẻ của con ngƣời. Tuy nhiên ngƣời đã bị suy giảm hệ miễn dịch không đƣợc sử dụng chế phẩm này.
1.3 TỔNG QUAN VỀ 1-NAPHTHOL
1.3.1 Giới thiệu về 1-naphthol
1–Naphthol là hydrocarbon thơm có chứa một nhóm -OH liên kết trực tiếp với carbon ở nhân thơm, thuộc họ phenol [36].
Công thức phân tử: C10H8O (144,17 g/mol). Công thức cấu tạo:
Tên gọi:
- IUPAC: 1-naphthol
- Tên gọi khác: α-naphthol, 1-hydroxynaphthalene, 1-naphthalenol, α-hydroxylnaphthalene, 1-naphthyl alcohol.
- Tên thƣơng mại và từ viết tắt: Oxidation base 33 (chất oxy hóa 33), Colorex 1NAP (chất màu 1-naphthol), Jarocol AN, Rodol ERN.
1.3.2 Tính chất vật lý
Ở điều kiện thƣờng, 1–naphthol tồn tại ở dạng tinh thể màu trắng hơi hồng xám, rất nhạy sáng (đổi màu khi tiếp xúc với ánh sáng) [9], [18].
Nhiệt độ nóng chảy: 96oC. Nhiệt độ sôi: 280oC.
Tan ít trong nƣớc, độ tan ở 20oC: 866 mg/l.
Tan tốt trong rƣợu, eter, benzene, chloroform, dung dịch kiềm… Hằng số phân ly ở 25oC: pKa = 9,34.
19
1.3.3 Tính chất hóa học
Do nguyên tử oxy còn dƣ hai cặp điện tử chƣa liên kết và thêm vào đó là hệ thống điện tử π có trong nhân thơm tạo nên hiệu ứng liên hợp làm cho liên kết C – O trở nên bền vững hơn [9].
- Hiệu ứng liên hợp này càng làm tăng sự phân cực trong liên kết O – H làm cho nguyên tử hydro dễ tách ra trong các phản ứng hóa học. Do đó 1-naphthol thể hiện tính acid mạnh hơn alcol. Tuy nhiên, tính acid của 1-naphthol vẫn yếu hơn tính acid của acid carboxylic và acid carbonic. - Hiệu ứng liên hợp kéo điện tích tập trung trong nhân thơm, làm cho mật
độ điện tử ở nhân thơm trở nên âm hơn. Vì vậy 1-naphthol có thể tham gia phản ứng thế ái điện tử.
Các muối naphtholate tác dụng với alkylhalogenua, clorua acid, alkyl sulfat tạo eter. 1-naphthol tham gia tất cả các phản ứng ái nhân, phản ứng thế nhóm O–H, phản ứng oxy hóa, phản ứng thế hydro ở nhân thơm, phản ứng ghép đôi với các hợp chất diazo [9].
1.3.4 Độc tính
Đối với cơ thể con người:
Là chất độc nếu nuốt phải hay hấp thu qua da, qua đƣờng hô hấp. 1-Naphthol kích thích đến mắt, ảnh hƣởng tới gan và thận. Cùng với 3,5,6-trichloro-2-pyridiol (một chất chuyển hoá của chlorpyrifos và chlorpyrifos
methyl), 1-naphthol làm giảm nồng độ testoterone ở nam giới trƣởng thành [22]. Kích thích hô hấp: xuất hiện các triệu chứng ho, thở dốc.
Nuốt phải liều lớn có thể gây ra đau bụng, buồn nôn, nôn mửa, đổ mồ hôi và khát cƣờng, tổn thƣơng tới gan, giảm huyết áp, tiêu chảy, mạch thu hẹp, gây co giật nếu có thể dẫn tới tử vong với liều 5g [5].
Với da: kích thích mẩn đỏ và gây đau đớn, có thể đƣợc hấp thu qua da, độ hấp thu cực đại qua da là 5,46 μg/cm2.
20
Về lâu dài, 1-naphthol ảnh hƣởng xấu đến chức năng của tuyến giáp [17]. Ngoài ra, 1-naphthol có thể tích tụ trong các mô và gây nên các khối u ở đại trực tràng [16].
Độc tính của 1-naphthol còn thể hiện gián tiếp qua chất chuyển hoá của nó là 1,2 hoặc 1,4-naphthoquinone [21].
Đối với sinh vật và môi trường:
1-naphthol ảnh hƣởng xấu đến cá, giun đất và động vật có vú với liều lƣợng nhất định.
Bảng 1.1. Độ độc của 1-naphthol với các loài sinh vật [5], [19].
Giun đất Tảo Cá Động vật có vú
Nồng độ độc (ppm) 17,8 14 4,24 134
1.3.5 Nguồn phát sinh 1-naphthol
1-naphthol có trong nƣớc thải của nhiều ngành công nghiệp (công nghiệp tổng hợp chất hữu cơ, sản xuất chất màu azo, thuốc trừ giun sán, thuốc trừ sâu, trong công nghệ thuộc da và sản xuất giấy…) [2].
Đặc biệt, 1-naphthol đƣợc xác định là sản phẩm chính của quá trình phân huỷ thuốc trừ sâu carbaryl trong điều kiện tự nhiên [18], [19].
1.4 MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ XỬ LÝ 1-NAPHTHOL
Đã có khá nhiều phƣơng pháp xử lý 1-naphthol đƣợc nghiên cứu trong những năm gần đây, nhƣ nghiên cứu của Chockalingam Karunakaran và cộng sự đã khảo sát hiệu suất xử lý 1-naphthol bằng phƣơng pháp xúc tác quang hoá trên bề mặt TiO2, ZnO [14]; nghiên cứu của Nguyễn Tuấn Lợi (2010) xử lý 1-naphthol bằng phƣơng pháp oxi hoá nâng cao sử dụng O3. Hiệu suất phân huỷ 1-naphthol bằng phƣơng pháp O3 kết hợp với UV, O3 kết hợp với H2O2 cũng đƣợc khảo sát [5]. Các kết quả thực nghiệm chỉ ra rằng phƣơng pháp oxi hoá nâng cao tỏ ra có hiệu quả khi xử lý dung dịch 1-naphthol nồng độ thấp (dƣới 20 ppm), nhƣng khi xử lý
21
dung dịch 1-naphthol nồng độ cao, phƣơng pháp này rất tốn kém và sau quá trình xử lý 1-naphthol, phải tiến hành xử lý lƣợng O3 còn dƣ trong dung dịch.
Với mong muốn tìm phƣơng pháp xử lý 1-naphthol hiệu quả và kinh tế, nhiều nghiên cứu trong nƣớc đã bƣớc đầu tiến hành khảo sát khả năng xử lý 1-naphthol sử dụng các nguyên vật liệu rẻ tiền, nhƣ nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Hạ (2010) sử dụng chiết xuất humin từ bã than bùn để xử lý 1-naphthol. Kết quả đƣợc ghi nhận khi pH giảm, dung lƣợng hấp phụ 1-naphthol lên humin tăng, quá trình hấp phụ 1-naphthol lên humin là quá trình hấp phụ vật lý. Dung lƣợng hấp phụ tối đa đạt đƣợc ở điều kiện thí nghiệm pH 0.91 là 15.15 mg/g humin sau 60 phút hấp phụ dung dịch 1-naphthol 100 ppm [2].
Một phƣơng pháp kinh tế và thân thiện với môi trƣờng cũng đƣợc khảo sát trong nghiên cứu của Phan Thị Thu Dung (2009). Tác giả Phan Thị Thu Dung đã tiến hành khảo sát khả năng thích nghi của ba chủng vi khuẩn Bacillus spp. trong môi trƣờng dinh dƣỡng có bổ sung 1-naphthol. Các kết quả ghi nhận chủng Bacillus subtilis có khả năng thích nghi tốt với môi trƣờng có bổ sung 1-naphthol và có thể phân huỷ đƣợc 1-naphthol (quá trình loại bỏ 1-naphthol trong dung dịch có nồng độ 80 ppm sau 74 giờ xử lý bằng Bacillus subtilis đạt hiệu suất trên 80%) [1].
Quá trình nuôi cấy Bacillus subtils đơn giản, ít tốn kém. Bacillus subtilis lại sinh sản nhanh. Phƣơng pháp xử lý bằng vi sinh vật đƣợc sử dụng trong nghiên cứu của Phan Thị Thu Dung tỏ ra ƣu điểm vƣợt trội về mặt kinh tế, có nhiều tiềm năng để ứng dụng thực tế. Tuy nhiên, nếu sử dụng tế bào Bacillus subtils tự do trong các thiết bị xử lý nƣớc thải sẽ xảy ra hiện tƣợng các tế bào tự do bị rửa trôi khỏi hệ thống xử lý. Để khắc phục nhƣợc điểm đó, tác giả Phan Thị Thu Dung đã tiến hành cố định tế bào Bacillus subtils lên humin và bƣớc đầu khảo sát so sánh khả năng xử lý 1-naphthol bằng Bacillus subtils tự do, bằng Bacillus subtils cố định trên humin, bằng humin tự do. Tuy nhiên, khi phân tích định lƣợng 1-naphthol còn lại trong dung dịch sau quá trình xử lý, Phan Thị Thu Dung sử dụng phƣơng pháp phổ hấp thu UV-VIS, kết quả cho độ hấp thu của 1-naphthol trong mẫu sau khi xử lý bằng
22
kiến nghị lặp lại thí nghiệm và sử dụng phƣơng pháp phân tích phù hợp để đánh giá chính xác hiệu quả xử lý 1-naphthol bằng Bacillus subtils cố định trên humin, đồng thời tìm điều kiện tối ƣu cho quá trình xử lý 1-naphthol bằng Bacillus subtils cố định trên humin.
Cho tới thời điểm thực hiện luận văn của chúng tôi, chƣa có nghiên cứu nào xây dựng điều kiện tối ƣu cho quá trình xử lý 1-naphthol bằng vi sinh cố định trên humin, chƣa có nghiên cứu nào khảo sát số lần tái sử dụng chế phẩm vi sinh cố định trên humin.
1.5 PHƢƠNG PHÁP VÀ THIẾT BỊ PHÂN TÍCH
1.5.1 Phƣơng pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
HPLC là viết tắt của High Performance Liquid Chromatography (phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao), trƣớc kia gọi là High Pressure Liquid Chromatography (phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp).
Phƣơng pháp này ra đời từ năm 1967 – 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phƣơng pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay phƣơng pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích. Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc. Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lƣợng [5].
1.5.1.1 Phân loại sắc ký
Theo cơ chế chia tách của sắc ký, ngƣời ta phân ra các loại sau đây: - Sắc ký hấp phụ (NP - HPLC và RP - HPLC).
- Sắc ký phân bố - sắc ký chiết (LLC). - Sắc ký trao đổi ion (IE - HPLC).
- Sắc ký rây phân tử - sắc ký gel (IG - HPLC).
Nhƣng thực tế hiện nay chúng ta hiện chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ vào phân tích mẫu .
23
Sắc ký hấp phụ [5]:
Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột. Trong loại này có 02 kiểu hấp phụ:
- Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP - HPLC): Pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực.
- Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC): Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực.
Loại sắc ký hấp phụ pha đảo đƣợc áp dụng rất rộng rãi, thành công để tách hỗn hợp các chất có tính chất gần tƣơng tự nhau và thuộc loại không phân cực, phân cực yếu hay trung bình.
Ưu điểm:
+ Tốc độ nhanh.
+ Độ tách tốt (nhờ sử dụng các chất nhồi có kích thƣớc rất nhỏ 5-10m). + Độ nhạy cao.
+ Cột tách đƣợc sử dụng nhiều lần, khả năng thu hồi mẫu cao.
+ Lƣợng mẫu cho phép bơm vào cột tách lớn hơn so với phƣơng pháp sắc ký khí.
+ Quá trình phân tích phần lớn đƣợc thực hiện tại nhiệt độ phòng, rất thích hợp cho các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi và không bền nhiệt (ƣu điểm rõ rệt của phƣơng pháp này so với phƣơng pháp sắc ký khí).
24
1.5.1.2 Hệ thống thiết bị HPLC
Hình 1.11. Hệ thống thiết bị phân tích HPLC [5].
Có thể sử dụng nhiều loại detector khác nhau để làm tăng khả năng phát hiện, tăng hiệu quả và độ chính xác của phép phân tích: detector hấp thu tử ngoại (ultra violet – UV), detector chiết suất vi sai (refractive index – RI), detector vận chuyển, detector huỳnh quang (fluorescence), detector hấp thu nhiệt, detector cực phổ, detector độ dẫn…
1.5.1.3 Ứng dụng của phƣơng pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phân tích định tính
Trong phƣơng pháp HPLC, ngƣời ta định tính mẫu bằng cách so sánh thời gian lƣu (tr) của cấu tử phân tích với chất chuẩn. Việc so sánh này chỉ có giá trị khi tiến hành thí nghiệm trên mẫu và chất chuẩn ở các điều kiện hoàn toàn giống nhau cả về pha tĩnh, pha động, nhiệt độ…
So với phƣơng pháp phổ hồng ngoại, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hoặc khối phổ, phƣơng pháp HPLC có vai trò kém quan trọng hơn trong phân tích định tính vì việc đánh giá sự hiện diện của các cấu tử dựa vào thời gian lƣu (tr) có độ chính xác không cao lắm.
Phƣơng pháp HPLC chỉ đƣợc xem là một công cụ đắc lực đƣợc sử dụng để đánh giá sự hiện diện hoặc vắng mặt của các hỗn hợp chứa một số giới hạn các cấu tử có thể đã đƣợc nhận danh trƣớc.
25
Phân tích định lượng
Cơ sở của phƣơng pháp dựa trên giả thiết rằng các biến đổi tín hiệu của detector có quan hệ mật thiết với sự biến đổi nồng độ của các chất đƣợc tách ra bằng sắc ký theo một tƣơng quan tỷ lệ thuận.
- Phương pháp dựa vào chiều cao peak:
Chiều cao peak đƣợc đo bằng cách nối đƣờng nền giữa hai chân của peak bằng một đƣờng thẳng và đo chiều cao của peak từ đƣờng nền này. Chỉ nên sử dụng phƣơng pháp này khi bề rộng của peak mẫu và peak chuẩn hoàn toàn bằng nhau. Điều này chỉ thực hiện đƣợc khi khống chế nghiêm ngặt nhiệt độ cột, tốc độ của pha động, tốc độ bơm mẫu và tránh cho cột không bị quá tải.
- Phương pháp dựa vào diện tích peak
Diện tích peak không phụ thuộc vào độ rộng của peak. Mặt khác diện tích peak rất dễ đƣợc xác định một cách chính xác, nhất là đối với các peak hẹp. Hầu hết các thiết bị sắc ký hiện đại đều có bộ tích phân kế điện tử cho phép xác định chính xác diện tích peak.
Phƣơng pháp 100% diện tích peak: Phƣơng pháp này hầu nhƣ không còn đƣợc sử dụng vì sai số rất lớn (ngoài hàm lƣợng của mẫu khảo sát, tín hiệu của detector còn phụ thuộc vào loại detector và bản chất hoá học của chất nghiên cứu).
Phƣơng pháp chuẩn ngoại: Lập đƣờng chuẩn diện tích peak theo nồng độ của cấu tử cần khảo sát. Chọn điều kiện thích hợp để quan hệ giữa diện tích peak và nồng độ là tuyến tính. Định lƣợng cấu tử cần khảo sát bằng việc xây dựng đƣờng chuẩn hoặc bằng phƣơng pháp bình phƣơng cực tiểu.
Phƣơng pháp chuẩn nội: Thêm vào mẫu một chất chuẩn có nồng độ biết trƣớc đƣợc gọi là chất chuẩn nội. Chất chuẩn nội có thể có tính chất hoá lý rất gần với cấu tử khảo sát hoặc có thể là một cấu tử nào đó có mặt trên sắc ký đồ. Độ chính xác của phƣơng pháp này không phụ thuộc vào độ lặp lại của quá trình bơm mẫu.
26
1.5.2 Phƣơng pháp phân tích quang phổ hấp thu UV-VIS (phổ kích thích electron) electron)
Thông qua việc khảo sát các đám phổ của miền tử ngoại gần đến miền hồng ngoại, phƣơng pháp phổ kích thích electron là một trong những phƣơng pháp đƣợc ứng dụng sớm nhất và rộng rãi nhất trong nghiên cứu cấu trúc các hợp chất hữu cơ, vô cơ, phức chất…
1.5.2.1 Nguyên tắc
Cho chùm ánh sáng có bƣớc sóng xác định đi qua vật thể hấp thu (thƣờng ở dạng dung dịch), dựa vào lƣợng ánh sáng đã bị hấp thu bởi dung dịch suy ra nồng độ của dung dịch.
1.5.2.2 Máy đo phổ hấp thu UV-VIS và nguyên lý hoạt động
Hình 1.12. Cấu tạo máy đo phổ hấp thu UV-VIS [5].
Nguyên lý hoạt động: Các bức xạ do nguồn cung cấp đƣợc bộ đơn sắc tách