Cân chính xác 0.025g 1-naphthol cho vào bercher. Hoà tan 1-naphthol bằng
50 ml methanol. Định mức bằng nƣớc cất đến 500 ml, thu đƣợc dung dịch 1-naphthol 500 ppm. Từ dung dịch gốc 1-naphthol 500 ppm pha loãng bằng nƣớc
cất đến các nồng độ 1 ppm, 20 ppm, 50 ppm, 80 ppm. Tiến hành quét phổ UV-VIS của các mẫu chuẩn nhằm xác định độ hấp thu cực đại của 1-naphthol trong vùng bƣớc sóng từ 190 – 400 nm. Kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.3.
2.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sắc ký đồ HPLC của dung dịch 1-naphthol và các yếu tố ảnh hƣởng
Hình 2.3. Sơ đồ khảo sát sắc ký đồ HPLC của 1-naphthol và các yếu tố ảnh hƣởng. 1-naphthhol Sắc ký đồ của 1-naphthhol Ảnh hƣởng của các loại nƣớc lọc dùng để pha loãng Nƣớc cất MT2 MT2 + humin MT2 + vi sinh MT2 + vi sinh + humin Ảnh hƣởng của pH
33
2.2.3.1 Thí nghiệm 3a: Khảo sát sắc ký đồ HPLC của dung dịch 1-naphthol
Pha dung dịch gốc 1-naphthol 500 ppm nhƣ ở thí nghiệm 2 (mục 2.2.2). Từ dung dịch gốc 1-naphthol 500 ppm pha loãng bằng nƣớc cất đến các nồng độ 1 ppm, 20 ppm, 50 ppm, 80 ppm, 100 ppm.
Các mẫu đã pha đƣợc lọc qua giấy lọc có kích thƣớc lỗ 0.2 µm trƣớc khi chạy HPLC ở bƣớc sóng 212 nm.
Từ đó xây dựng đƣờng chuẩn Speak = f(C) dựa vào nồng độ chất phân tích và diện tích peak tƣơng ứng.
Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
2.2.3.2 Thí nghiệm 3b: Khảo sát ảnh hƣởng của các loại nƣớc lọc dùng để pha loãng dung dịch 1-naphthol dùng trong phân tích định lƣợng HPLC
Sử dụng các loại nƣớc lọc khác nhau để pha loãng dung dịch gốc 1-naphthol 500 ppm thành các dung dịch 50 ppm.
Các loại nƣớc lọc để pha loãng mẫu bao gồm: Nƣớc cất, MT2, MT2 có bổ sung humin, MT2 có bổ sung vi sinh, MT2 có bổ sung vi sinh và humin.
Lọc các mẫu đã pha loãng qua giấy lọc có kích thƣớc lỗ 0.2 µm.
Tiến hành phân tích định lƣợng mẫu bằng máy HPLC ở bƣớc sóng 212 nm. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.2.
2.2.3.3 Thí nghiệm 3c: Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến sắc ký đồ HPLC của 1-naphthol
Pha loãng dung dịch gốc 1-naphthol 500 ppm bằng dung dịch MT2 thành các dung dịch 50 ppm. Sử dụng dung dịch Na2CO3 để điều chỉnh pH của dung dịch về các giá trị khác nhau: 6.0; 6.5; 7.0; 7.5.
Lọc các mẫu đã pha loãng qua giấy lọc có kích thƣớc lỗ 0.2 µm.
Tiến hành phân tích định lƣợng mẫu bằng máy HPLC ở bƣớc sóng 212 nm. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.3.
34
2.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát quá trình tăng sinh khối theo thời gian của chủng Bacillus subtilis
2.2.4.1 Cấy giống và bảo quản giống
Giống Bacillus subtilis đƣợc cấy và bảo quản trên môi trƣờng MT1 có bổ sung agar.
Cấy chuyền và ủ giống ở nhiệt độ 37oC trong 1 ngày. Bảo quản ở 4oC. Việc cấy chuyền đƣợc thực hiện sau mỗi 2 tuần để duy trì giống.
2.2.4.2 Giai đoạn nhân giống
Cấy giống từ môi trƣờng thạch nghiêng sang môi trƣờng thạch đĩa. Mục đích để đảm bảo thí nghiệm đƣợc tiến hành với giống Bacillus subtilis thuần, không tạp nhiễm.
Nhân giống cấp 1: Bắt 1 khuẩn lạc thuần từ môi trƣờng thạch đĩa cho vào bình 1 có chứa 10 ml MT1 đã hấp khử trùng. Nuôi trên máy lắc tròn ở nhiệt độ phòng, trong 24 giờ, tốc độ lắc 150 vòng/phút.
Nhân giống cấp 2: Chuyển hết 10 ml dịch sinh khối ở bình 1 vào bình 2 có chứa 90 ml MT1 đã hấp khử trùng. Nuôi trên máy lắc tròn ở nhiệt độ phòng, tốc độ lắc 150 vòng/phút.
Mục đích của giai đoạn nhân giống: Đảm bảo lƣợng sinh khối ổn định cho quá trình xử lý 1-naphthol.
2.2.4.3 Khảo sát quá trình tăng sinh khối theo thời gian của chủng Bacillus subtilis
Mục đích: Xác định pha sinh trƣởng của chủng Bacillus subtilis, nhằm xác định thời điểm thích hợp để thu nhận sinh khối cho các thí nghiệm xử lý 1-naphthol.
Sơ đồ khảo sát đƣợc trình bình ở hình 2.4. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.4 và 3.5.
Dựa vào đƣờng cong sinh trƣởng, xác định thời điểm thu nhận sinh khối
35
Hình 2.4. Sơ đồ khảo sát quá trình tăng sinh khối theo thời gian của
Bacillus subtilis.
2.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng xử lý 1-naphthol của các phƣơng pháp khác nhau
2.2.5.1 Tạo chế phẩm vi sinh cố định trên humin
Sinh khối thu đƣợc từ thí nghiệm 4 mục 2.2.4.3 (thu sinh khối ở thời điểm 24 giờ sau khi nhân giống cấp 2) sẽ đƣợc cố định trên humin theo nhƣ mô tả của Phan Thị Thu Dung: 10 ml dịch sinh khối, 0.1g humin, nuôi trên máy lắc tròn ở
B. sub
Lấy mẫu đo OD600 sau mỗi 3 giờ (khảo sát trong 30 giờ)
Nhân giống cấp 1
Nhân giống cấp 2
Lấy mẫu trải đĩa sau mỗi 3 giờ (khảo sát trong 30 giờ)
Mối tƣơng quan giữa OD và số lƣợng tế bào [10]
Đƣờng cong sinh trƣởng của B. sub
(Mối tƣơng quan giữa thời gian và số lƣợng tế bào)
36
nhiệt độ phòng, tốc độ lắc 150 vòng/phút, thời gian 3 giờ [1]. Sau đó, đem ly tâm, thu chế phẩm vi sinh cố định trên humin để sử dụng cho các khảo sát tiếp theo.
2.2.5.2 So sánh khả năng xử lý 1-naphthol bằng vi sinh cố định trên humin với các phƣơng pháp khác
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng xử lý 1-naphthol bằng các phƣơng pháp khác nhau.
Mục đích: Dựa trên việc so sánh hiệu quả xử lý 1-naphthol của các phƣơng pháp, đánh giá khả năng ứng dụng vào thực tế của phƣơng pháp xử lý 1-naphthol bằng chế phẩm vi sinh cố định trên humin.
Thí nghiệm khảo sát khả năng xử lý 1-naphthol bằng các phƣơng pháp khác nhau đƣợc tiến hành ở 3 trƣờng hợp:
- Sử dụng chế phẩm vi sinh cố định trên humin: Bổ sung chế phẩm vi sinh
cố định trên humin vào bình có chứa 100 ml MT2 (có bổ sung 1-naphthol 50 ppm).
Khảo sát khả năng xử lý 1-naphthol bằng vi sinh tự do
So sánh hiệu quả xử lý 1-naphthol của các phƣơng pháp
Khảo sát khả năng xử lý 1-naphthol
bằng humin Khảo sát khả năng xử
lý 1-naphthol bằng vi sinh cố định trên humin
Vi sinh cố định trên humin Humin Vi sinh tự do H umin H umin
37
- Sử dụng vi sinh tự do: Bổ sung lƣợng vi sinh thu đƣợc khi ly tâm 10 ml dịch sinh khối sau giai đoạn nhân giống cấp 2 vào bình có chứa 100 ml MT2 (có bổ sung 1-naphthol 50 ppm).
- Sử dụng humin tự do: Bổ sung 0.1g humin vào bình có chứa 100 ml MT2 (có bổ sung 1-naphthol 50 ppm).
Nuôi trên máy lắc tròn ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, lắc150 vòng/phút. Ở các thời điểm cần khảo sát, ly tâm dịch sau nuôi cấy, thu phần dịch trong, đem lọc qua giấy lọc có kích thƣớc lỗ 0.2 µm. Hàm lƣợng 1-naphthol còn lại trong dịch đƣợc đo ở ngày 0, 1, 2, 3, 4 bằng máy HPLC ở bƣớc sóng 212 nm.
Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.6 và 3.7.
2.2.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng xử lý 1-naphthol bằng chế phẩm vi sinh cố định trên humin
Mục đích: Quá trình xử lý 1-naphthol của chế phẩm vi sinh cố định trên humin chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố (quá trình cố định, pH của môi trƣờng dinh dƣỡng, nồng độ 1-naphthol ban đầu…). Chúng tôi tiến hành khảo sát tất cả các yếu tố này nhằm tìm hiểu mức độ ảnh hƣởng của mỗi yếu tố, từ đó lựa chọn điều kiện tối ƣu cho quá trình xử lý 1-naphthol bằng chế phẩm vi sinh cố định trên humin.
2.2.6.1 Thí nghiệm 6a: Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng humin sử dụng trong giai đoạn tạo chế phẩm vi sinh cố định đến khả năng xử lý 1-naphthol
Khảo sát ở các hàm lƣợng 0.05g; 0.10g; 0.15g humin để cố định 10 ml dịch sinh khối. Sơ đồ khảo sát đƣợc trình bày ở hình 2.6.
Quá trình tạo chế phẩm cố định tƣơng tự nhƣ ở thí nghiệm 5 (mục 2.2.5.1). Các chế phẩm cố định đƣợc bổ sung vào bình có chứa 100 ml MT2 (có bổ sung 1-naphthol 50 ppm). Nuôi trên máy lắc tròn ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, lắc 150 vòng/phút.
Ở các thời điểm cần khảo sát, lấy mẫu, ly tâm thu lấy dịch trong. Đem dịch trong lọc qua giấy lọc có kích thƣớc lỗ 0.2 µm. Hàm lƣợng 1-naphthol còn lại trong dịch đƣợc đo ở ngày 0, 1, 2, 3 bằng máy HPLC ở bƣớc sóng 212 nm.
38 Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.8 và 3.9.
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng humin trong quá trình tạo chế phẩm cố định đến khả năng xử lý 1-naphthol. 2.2.6.2 Thí nghiệm 6b: Khảo sát ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến khả năng xử lý 1-naphthol bằng chế phẩm vi sinh cố định trên humin
Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến khả năng xử lý 1-naphthol bằng chế phẩm vi sinh cố định trên humin - đƣợc tiến hành ở 4 điều kiện pH khác nhau là 6.0; 6.5; 7.0; 7.5. Sử dụng dung dịch Na2CO3 10% để điều chỉnh pH môi trƣờng về các giá trị cần khảo sát.
Sử dụng tỷ lệ 0.05 g humin và 10ml dịch sinh khối để tạo chế phẩm cố định.
Bổ sung chế phẩm cố định vào các bình chứa 100 ml MT2 đã đƣợc điều chỉnh về các giá trị pH cần khảo sát (có bổ sung 1-naphthol 50 ppm). Nuôi trên máy lắc tròn ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, lắc 150 vòng/phút. B. sub Humin 0.15 g humin và 10 ml dịch sinh khối Chế phẩm cố định Khảo sát khả năng xử lý 1-naphthol 0.01 g humin và 10 ml dịch sinh khối 0.05 g humin và 10 ml dịch sinh khối
39
Ở các thời điểm cần khảo sát, lấy mẫu, ly tâm mẫu thu lấy dịch trong đem lọc qua giấy lọc có kích thƣớc lỗ 0.2 µm. Hàm lƣợng 1-naphthol còn lại trong dịch đƣợc đo ở ngày 0, 1, 2, 3 bằng máy HPLC ở bƣớc sóng 212 nm.
Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.10 và 3.11.
2.2.6.3 Thí nghiệm 6c: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ 1-naphthol ban đầu đến khả năng xử lý 1-naphthol bằng chế phẩm vi sinh cố định trên humin
Thí nghiệm đƣợc tiến hành ở các nồng độ 50 ppm, 80 ppm, 100 ppm, 125 ppm, 150 ppm, 200 ppm, 250 ppm, 400 ppm.
Sử dụng 0.05 g humin và 10 ml dịch sinh khối để tạo chế phẩm cố định. Bổ sung chế phẩm cố định vào các bình chứa 100 ml MT2 (pH 6.5). Nuôi trên máy lắc tròn ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, lắc 150 vòng/phút.
Ở thời điểm cần khảo sát, lấy mẫu, ly tâm mẫu thu lấy dịch trong đem lọc qua giấy lọc có kích thƣớc lỗ 0.2 µm. Hàm lƣợng 1-naphthol còn lại trong dịch, đƣợc đo ở ngày 0, 2 bằng máy HPLC ở bƣớc sóng 212 nm.
Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.12.