Dụng cụ và hóa chất - Mẫu quặng bentonite Di Linh - HCl - AgNO3 - Erlen 500ml - Máy khuấy từ - Ống sinh hàn
- Máy lọc chân không - Tủ sấy
Phương pháp
Áp dụng qui trình biến tính bentonite theo tài liệu [3]: cho 50 g bentonite tinh chế vào 150 ml dung dịch HCl 5% trong erlen 500 ml, đặt trên máy khuấy từ điều chỉnh nhiệt độ 600C, lắp hệ thống sinh hàn, nhiệt kế, khuấy liên tục trong khoảng thời gian 4 giờ (hình 2.3). Sau đó lọc hỗn hợp bằng máy lọc chân không thu được phần sét, rửa sét bằng nước cất cho đến khi không còn ion Cl- (thử bằng dung dịch AgNO3 0,5% cho đến khi không còn xuất hiện kết tủa trắng). Sấy khô sét thu được ở 1200C trong 2 giờ, nghiền sản phẩm và rây trên rây cỡ 100 mesh. Bột thu được là bentonite- HCl 5%.
Tiến hành tương tựđối với HCl có nồng độ lần lượt là 7%, 10%, 12% và khảo sát khả năng hấp phụ sơ bộ để chọn ra loại bentonite – HCl tốt nhất để thí nghiệm
3.3.2. Khảo sát biến tính bentonite bằng HNO3Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ và hóa chất - Mẫu quặng bentonite Di Linh - HNO3 - Erlen 500ml - Máy khuấy từ - Ống sinh hàn
- Máy lọc chân không - Tủ sấy
Phương pháp
Áp dụng qui trình biến tính bentonite theo tài liệu [3]: cho 50 g bentonite tinh chế vào 150 ml dung dịch HNO3 5% trong erlen 500 ml, đặt trên máy khuấy từđiều chỉnh nhiệt độ 600C, lắp hệ thống sinh hàn, nhiệt kế, khuấy liên tục trong khoảng thời gian 4 giờ. Sau đó lọc hỗn hợp bằng máy lọc chân không thu được phần sét, rửa sét bằng nước cất cho đến khi không còn ion H+ (thử bằng giấy quỳ tím cho đến khi không thấy đổi màu). Sấy khô sét thu được ở 1200C trong 2 giờ, nghiền sản phẩm và rây trên rây cỡ 100 mesh. Bột thu được là bentonite-HNO3 5%.
Tiến hành tương tự đối với HNO3 có nồng độ lần lượt là 7%, 10%, 12% và khảo sát khả năng hấp phụ sơ bộ để chọn ra loại bentonite – HNO3 tốt nhất để thí nghiệm khảo sát các yếu tốảnh hưởng đến quá trình hấp phụ.
3.3.3. Khảo sát biến tính bằng kiềm và nhiệt Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ và hóa chất
- Mẫu quặng bentonite Di Linh - NaOH
- Erlen 500ml - Máy khuấy từ
- Ống sinh hàn
- Máy lọc chân không - Tủ sấy
Phương pháp
Biến tính bằng kiềm: cho 50 g bentonite tinh chế vào 150 ml dung dịch NaOH 5% trong erlen 500 ml, đặt trên máy khuấy từ điều chỉnh nhiệt độ 600C, lắp hệ
thống sinh hàn, nhiệt kế, khuấy liên tục trong khoảng thời gian 4 giờ. Sau đó lọc hỗn hợp bằng máy lọc chân không thu được phần sét, rửa sét bằng nước cất. Sấy khô sét thu được ở 1200C trong 2 giờ, nghiền sản phẩm và rây trên rây cỡ 100 µm. Bột thu được là bentonite-NaOH 5%.
Biến tính bằng nhiệt: cân 50g bentonite tinh chế, sấy ở 1500C trong 4 giờ, thu
được bentonite-nhiệt.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình biến tính: nồng độ axit, loại axit được
đánh giá sơ bộ bởi phân tích nhiễu xạ tia X và khả năng hấp phụ vi khuẩn E.coli.
3.4. Phương pháp định lượng vi sinh vật [4] Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ và hóa chất - Erlen 500ml - Đĩa petri - Ống nghiệm - Pipet Pastuer - Nồi hấp tiệt trùng - Tủ lạnh, tủ sấy, tủ cấy tiệt trùng - Nutrient Broth:
+ Môi trường lỏng dinh dưỡng Nutrient Broth (NB) tiệt trùng, dùng để hoạt hóa giống.
+ Môi trường rắn dinh dưỡng Nutrient Agar (NA): bổ sung 1,5% agar vào môi trường NB, tiệt trùng, làm thạch nghiêng giữ giống.
- E.Coli được mua từ phòng gốc giống viện Pastuer, thành phố Hồ Chí Minh.
- E.coli được giữ trên thạch nghiêng dinh dưỡng NA, trữở 50C. Sau đó vi sinh vật sử dụng sẽ được cấy truyền hàng ngày trong môi trường dinh dưỡng NB, lắc trong khoảng 10 ÷ 16 giờ.
3.4.1. Xác định trực tiếp số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu 3.4.1.1. Cấu tạo buồng đếm hồng cầu 3.4.1.1. Cấu tạo buồng đếm hồng cầu
Buồng đếm hồng cầu là một phiến kính dày hình chữ nhật, giữa là phần lõm phẳng, tại đây có kẻ một lưới gồm 400 hình vuông nhỏ có diện tích tổng cộng là 1mm2. Ô trung tâm được khoanh tròn và có 25 ô vuông lớn; mỗi ô vuông lớn gồm 16 ô vuông nhỏ. Vì thế diện tích một hình vuông nhỏ là 1/400mm2 và hình vuông lớn hơn là 1/25mm2.
3.4.1.2. Cách tiến hành
- Đặt lá kính (lamelle) lên khu cực buồng đếm.
- Lắc mạnh dịch huyền phù tế bào, nhỏ một giọt lên bề mặt buồng đếm bằng pipet Pasteur, tránh tạo bọt khí.
- Đặt buồng đếm vào bàn kính hiển vi và để yên vài phút.
- Chỉnh kính hiển vi, với vật kính x40, tìm mạng ô đếm ở khu vực buồng đếm. Chỉnh thị trường sao cho một thị trường chứa trọn một ô lớn (4 x 4=16 ô nhỏ).
- Đếm số tế bào hiện diện trong một ô lớn và đếm ít nhất là 5 ô lớn. Lấy trị số
trung bình và tính toán kết quả.
3.4.1.3. Cách tính mật độ tế bào.
Mỗi ô nhỏ có diện tich1/400mm2 và một ô lớn là 1/25mm2. Bề dày của khoảng trống buồng đếm là 1/10mm. Do vậy, mỗi ô lớn có thể tích là 1/250mm3 hay 1/250.10-3 = 4.10-6 ml.
Suy ra mật độ tế bào: N = 0,25a . 106 CFU/ml ( a là số tế bào bình quân trong một ô lớn)
3.4.2. Định lượng tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang OD610nm3.4.2.1. Nguyên tắc 3.4.2.1. Nguyên tắc
Số lượng tế bào vi sinh vật trong môi trường có thể được xác định một cách gián tiếp nhờ phương pháp đo mật độ quang. Theo phương pháp này, số lượng photon ánh sáng bị phân tán tỉ lệ thuận với lượng sinh khối tế bào có trong mẫu đem
đo (trừ những trường hợp mẫu có mật độ tế bào đậm đặc), hay trong những điều kiện sinh trưởng nhất định thì tỉ lệ với mật độ tế bào.
3.4.2.2. Cách tiến hành
a. Thiết lập đường cong chuẩn
- Thực hiện pha loãng huyền phù tế bào sao cho thu được các huyền phù có OD610 là 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5;… Dùng buồng đếm hồng cầu để xác định mật
độ tế bào tương ứng với các huyền phù có OD610 khác nhau.
- Xây dựng đường cong chuẩn biểu diễn mật tế bào (CFU/ml) theo độ hấp thu.
b. Xác định mật độ tế bào
- Với dịch huyền phù tế bào vi khuẩn cần xác định (huyền phù X), pha loãng dịch này (nếu cần thiết) đến các nồng độ khác nhau.
- Tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 610 nm trên máy đo mật độ quang. - Nếu trị số OD610 nhận được nằm ngoài vùng tương quan tuyến tính giữa mật
độ tế bào (CFU/ml) và OD610 thì tiến hành pha loãng huyền phù này để có trị
số OD610 nằm trong vùng tuyến tính. Sử dụng đường cong chuẩn để suy ra mật độ cần tìm. Trong trường hợp có pha loãng thì mật độ tế bào cần tìm là mật độ tế bào suy ra từđồ thị nhân với hệ số pha loãng.
3.4.3. Xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng các khuẩn lạc 3.4.3.1. Nguyên tắc 3.4.3.1. Nguyên tắc
Một tế bào có thể phân chia theo cấp số nhân cho đến khi hình thành một khuẩn lạc có thể trông thấy được. Đây là cơ sở của việc định lượng tế bào trên thạch
đĩa, bởi vì số lượng khuẩn lạc sinh ra từ một thể tích giống vi sinh vật nhất định chỉ
số lượng tế bào sống có trong thể tích giống đó. Thông thường, tất cả các tế bào ở
pha tăng trưởng hay ở giai đoạn sớm của pha ổn định đều có khả năng hình thành khuẩn lạc. Vì vậy, số lượng khuẩn lạc đếm được gần như tương đương với số lượng tế bào sống.
3.4.3.1. Cách tiến hành
- Pha loãng mẫu: do chưa biết được nồng độ vi sinh vật trong mẫu, ta tiến hành pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-1; 10-2; 10-3; 10-4;…
- Nấu chảy môi trường NA đã hấp tiệt trùng, sau đó đổ vào đĩa petri đã khử
trùng, để nguội.
- Dùng pipet Pasteur hút 1 ml mẫu ở các độ pha loãng khác nhau cho vào các
đĩa petri chứa môi trường.
- Nuôi ủở nhiệt độ phòng trong vòng 24 giờ.
- Đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa. Chọn nồng độ pha loãng có số khuẩn lạc (A) nằm trong khoảng 20 ÷ 250.
- Tính số lượng tế bào sống (N) có trong 1ml mẫu như sau: N = A . d (CFU/ml)
Trong đó: A là số khuẩn lạc đếm được trên đĩa. d là số lần pha loãng.
3.5. Phương pháp đánh giá khả năng hấp phụ E.coli của bentonite 3.5.1. Khảo sát nồng độ bentonite ảnh hưởng đến khả năng hấp phụ
- Tiến hành hoạt hóa giống E.coli trong môi trường dinh dưỡng NB trong khoảng 10 ÷ 16 giờ.
- Pha loãng huyền phù vi khuẩn E.coli đến 10-1; 10-2; 10-3;…
- Tiến hành xác định số lượng tế bào trong dung dịch đã pha loãng bằng phương pháp đếm số lượng các khuẩn lạc.
- Hút 2 ml dung dịch có độ pha loãng là 10-3 cho vào các ống nghiệm, sau
đó cho bentonite thô và các loại bentonite đã hoạt hóa vào từng ống nghiệm với nồng độ khảo sát, lắc các mẫu trong khoảng thời gian xác
định, ở nhiệt độ 300C, sau đó đem ly tâm với tốc độ 2000 vòng/phút. Dịch lỏng được tách ra khỏi bentonite và đem đi xác định số lượng vi sinh vật còn lại bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
Hiệu suất của quá trình hấp phụ E.coli tính (A) được tính như sau:
Trong đó: + C0 là mật độ vi khuẩn trước khi xử lý hấp phụ (CFU/ml) + C là mật độ vi khuẩn sau khi xử lý hấp phụ (CFU/ml)
Ngoài ra để đánh giá chính xác hiệu quả hấp phụ E.coli trên một lượng bentonite xác định người ta dùng đại lượng Ai gọi là hiệu suất hấp phụ tính theo số
lượng vi khuẩn bị hấp phụ trên 1g bentonite.
Với m là khối lượng bentonite (g)
3.5.2. Khảo sát thời gian tiếp xúc ảnh hưởng đến khả năng hấp phụ
- Tiến hành hoạt hóa giống E.coli trong môi trường dinh dưỡng NB trong khoảng 10 ÷ 16 giờ.
- Pha loãng huyền phù vi khuẩn E.coli đến 10-1; 10-2; 10-3;…
- Tiến hành xác định số lượng tế bào trong dung dịch đã pha loãng bằng phương pháp đếm số lượng các khuẩn lạc.
- Hút 2 ml dung dịch có độ pha loãng là 10-3 cho vào các ống nghiệm, sau đó cho bentonite thô và các loại bentonite đã hoạt hóa vào từng
ống nghiệm với nồng độ bentonite xác định, các mẫu được lắc trong khoảng thời gian khảo sát.
- Cứ sau một khoảng thời gian khảo sát thì tiến hành xác định số lượng vi sinh vật còn lại trong mỗi ống nghiệm cũng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
Hiệu suất của quá trình hấp phụ tính (A) được tính như sau:
Trong đó: + C0 là mật độ vi khuẩn trước khi xử lý hấp phụ (CFU/ml) + C là mật độ vi khuẩn sau khi xử lý hấp phụ (CFU/ml)
CHƯƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả biến tính bentonite
Bentonite sau khi tinh chế được trao đổi với HCl 5%, HNO3 5%, NaOH và biến tính bằng nhiệt độ.
Những loại bentonite này được đem đi phân tích cấu trúc bằng nhiễu xạ tia X (XRD) tại phòng X-ray thuộc Phòng phân tích hóa lý – Viện Khoa học vật liệu
ứng dụng trên máy Siemens D5000 (Đức). Kết quả phân tích được biểu diễn từ hình 3.1 đến 3.5.
Hình 4.3. Giản đồ XRD của bentonite-HNO3 5%
Kết quả phân tích XRD của các loại bentonite cho thấy: tất cả giản đồ nhiễu xạđều xuất hiện 3 peak đặc trưng cho khoáng montmorillonite là các peak 2θ = 60; 2θ = 200 và 2θ = 35,30. Peak tại 2θ = 210đặc trưng cho khoáng quart. Đối với loại bentonite-Na còn xuất hiện 1 peak tương đối mạnh tại 2θ = 29,50 tương ứng với khoáng canxit, riêng với các loại bentonite biến tính bằng axit thì không thấy xuất hiện peak này. Điều này có thể là do axit đã hoà tan khoáng canxit và một số oxit kim loại. Ngoài ra giản đồ XRD còn cho thấy sự xuất hiện của các khoáng nontronite, microlin, abit,…với hàm lượng không lớn [9].
4.2. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc đến hiệu suất hấp phụ
Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc đến khả năng hấp phụ vi khuẩn E.coli trên
các loại bentonite được khảo sát trong khoảng thời gian thay đổi từ 1 giờđến 4 giờ, nồng độ bentonite là 0,05 g/ml, nhiệt độ 300C . Kết quảđược trình bày trên bảng 3.1
đến bảng 3.5 và hình 3.6 đến hình 3.11.
Thời gian (giờ) 0 1 2 3 4
C0 (CFU/ml) 1,2.106 1,2.106 1,2.106 1,2.106 1.2.106 C (CFU/ml) 1.2.106 39.103 28.103 23.103 19.103 A (%) 0 96,75 97,67 98,08 98,42
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc đến hiệu suất hấp phụ trên bentonite tinh chế
Bentonite tinh chế 0 20 40 60 80 100 120 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 Thời gian tiếp xúc (giờ) H i ệ u s u ấ t h ấ p p h ụ ( % ) Thời gian (giờ) 0 1 2 3 4 C0 (CFU/ml) 1,2.106 1,2.106 1,2.106 1,2.106 1,2.106 C (CFU/ml) 1,2.106 6.103 5,2.103 3,4.103 3.103 A (%) 0 99,5 99,57 99,72 99,75 Bentonite-HCl 5% 0 20 40 60 80 100 120 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 Thời gian tiếp xúc (giờ) H i ệ u s u ấ t h ấ p p h ụ ( % ) Thời gian (giờ) 0 1 2 3 4 C0 (CFU/ml) 1,2.106 1,2.106 1,2.106 1,2.106 1,2.106
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc đến hiệu suất hấp phụ trên bentonite HCl 5%
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc đến hiệu suất hấp phụ trên bentonite-HNO3 5%
Hình 4.6. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc đến hiệu suất hấp phụ trên bentonite tinh chế
Hình 4.7. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc đến hiệu suất hấp phụ trên bentonite-HCl 5%
C (CFU/ml) 1,2.106 37.103 14.103 5,3.103 3,9.103 A (%) 0 96,91 98,83 99,56 99,67 Bentonite-HNO3 5% 0 20 40 60 80 100 120 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 Thời gian tiếp xúc (giờ) H i ệ u s u ấ t h ấ p p h ụ ( % ) Thời gian (giờ) 0 1 2 3 4 C0 (CFU/ml) 1,2.106 1,2.106 1,2.106 1,2.106 1,2.106 C (CFU/ml) 1,2.106 20.103 18.103 6,8.103 5,7.103 A (%) 0 98,33 98,5 99,43 99,53 Bentonite-NaOH 0 20 40 60 80 100 120 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
Thời gian tiếp xúc (giờ)
H i ệ u s u ấ t h ấ p p h ụ ( % ) Thời gian (giờ) 0 1 2 3 4 C0 (CFU/ml) 1,2.106 1,2.106 1,2.106 1,2.106 1,2.106
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc đến hiệu suất hấp phụ trên bentonite-nhiệt
Hình 4.8. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc đến hiệu suất hấp phụ trên bentonite-HNO3 5%
Hình 4.9. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc đến hiệu suất hấp phụ trên bentonite-NaOH
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc đến hiệu suất hấp phụ trên bentonite-NaOH
A (%) 0 95,58 98,5 98,75 99,25 Bentonite-nhiệt 0 20 40 60 80 100 120 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 Thời gian tiếp xúc (giờ) H i ệ u s u ấ t h ấ p p h ụ ( % ) 0 0 0 0 0 99,75 99,72 99,57 99,5 99,53 99,43 98,5 98,33 99,67 99,56 98,83 96,91 98,42 98,08 96,75 97,67 99,25 98,75 95,58 98,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
Thời gian tiếp xúc (giờ)
H i ệ u s u ấ t h ấ p p h ụ ( % )
Bentonite-HCl 5% Bentonite-NaOH Bentonite-HNO3 5%
Bentonite tinh chế Bentonite-nhiệt
Từ hình 3.6 đến hình 3.11 có thể thấy rằng tất cả các loại bentonite sau thời gian tiếp xúc 1 giờđã hấp phụ gần như hoàn toàn vi khuẩn E.coli với hiệu suất hấp