Cỏch tiến hành

a. Pha loóng mẫu thử:

Mẫu ban đầu đƣợc pha loóng trong DMSO và nƣớc cất tiệt trựng thành một dóy 05 nồng độ hoặc theo yờu cầu và mục đớch thử. Nồng độ thử cao nhất đối với dịch chiết là 256g/ml và với chất sạch là 128g/ml.

b. Thử hoạt tớnh

Lấy 10l dung dịch mẫu thử ở cỏc nồng độ vào đĩa 96 giếng, thờm 200l dung dịch vi khuẩn và nấm cú nồng độ 5.105CFU/ml, ủ ở 37o

C/24h.

c. Xử lý kết quả

- Giỏ trị MIC đƣợc xỏc định tại giếng cú nồng độ chất thử thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phỏt triển của vi sinh vật.

- Giỏ trị IC50 đƣợc tớnh toỏn dựa trờn số liệu đo độ đục của mụi trƣờng nuụi cấy bằng mỏy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng 2 THỰC NGHIỆM 2.1. HểA CHẤT, DỤNG CỤ Húa chất - Thiosemicacbazit - Isatin - Etanol - NiCl2 - ZnCl2 - CuCl2 - PdCl2 - Dung dịch amoniac - Dung dịch axit HCl loóng - Nƣớc cất

Dụng cụ

- Mỏy khuấy từ gia nhiệt

- Cốc thủy tinh 25ml, 50ml, 100ml - Pipet 1ml, 5ml, 10ml - Bỡnh định mức 50ml, 100ml - Tủ sấy chõn khụng - Cõn phõn tớch - Con khuấy từ

- Phễu lọc đỏy thủy tinh xốp - Giấy lọc băng xanh

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU VÀ KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM

2.2.1. Tổng hợp phối tử

Phối tử đƣợc tổng hợp theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tổng hợp phối tử thiosemicacbazon

Tổng hợp thiosemicacbazon isatin (Hthisa)

Hũa tan 0,91g (0,01 mol) thiosemicacbazit vào 30 ml nƣớc đó điều chỉnh mụi trƣờng bằng HCl đến pH: 1 – 2, khuấy cho đến khi tan hết tạo dung dịch trong suốt. H+ (pH: 1 – 2) O C R1 R2 H2N NH C H2N S N NH C H2N S C R1 R2

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hũa tan 1,47g (0,01mol) isatin trong etanol, đun nhẹ, khuấy cho đến khi tan hết.

Trộn hai dung dịch trờn với nhau, khuấy đều hỗn hợp ở nhiệt độ phũng trờn mỏy khuấy từ sẽ thấy xuất hiện kết tủa màu vàng sỏng tỏch ra, tiếp tục khuấy thờm 2 giờ nữa. Kết tủa này đƣợc lọc và rửa nhiều lần bằng nƣớc cất, hỗn hợp rƣợu nƣớc và cuối cựng bằng rƣợu trờn phễu lọc đỏy thuỷ tinh xốp. Làm khụ sản phẩm trong bỡnh hỳt ẩm đến khối lƣợng khụng đổi.

Độ tan của phối tử Hthisa đƣợc xỏc định sơ bộ trong một số dung mụi: Etanol, DMF, CHCl3, CH2Cl2,CH3Cl…

2.2.2. Tổng hợp phức chất

Cỏc phức chất đƣợc tổng hợp theo sơ đồ chung sau:

pH=8-9

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ tổng hợp cỏc phức chất của Ni2+

, Cu2+,Pd2+,Zn2+ với thiosemicacbazon

Tổng hợp phức chất của M (M: Ni2+, Cu2+, Pd2+, Zn2+) với Hthisa

Hỳt 10 ml dung dịch muối MCl2 0,2M (2 mmol) cho vào cốc chịu nhiệt loại 100ml, điều chỉnh mụi trƣờng đến pH khoảng 9 -10 bằng dung dịch NH3.Cõn 0,88g (4 mmol) Hthisa hoà tan vào 30 ml etanol núng.

Sau đú đổ hai dung dịch này vào nhau và khuấy đều trờn mỏy khuấy từ ở nhiệt độ phũng sẽ thấy xuất hiện kết tủa. Tiếp tục khuấy hỗn hợp này thờm 2 giờ nữa để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Lọc, rửa kết tủa trờn phễu lọc thuỷ

N NH C H2N S C R1 R2 dd MCl2 (M: Pd2+ , Ni2+, Cu2+,Zn2+) Phức chất của M với thiosemicacbazon

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

tinh đỏy xốp bằng nƣớc, hỗn hợp rƣợu nƣớc, rƣợu, cuối cựng bằng đietyl ete. Làm khụ chất rắn đến khối lƣợng khụng đổi trong bỡnh hỳt ẩm để tiến hành cỏc nghiờn cứu tiếp theo

Cỏc phức chất thu đƣợc cú màu sắc và một số dung mụi hũa tan chỳng đƣợc liệt kờ trong bảng sau:

Bảng 2.1: Kớ hiệu cỏc phức chất, màu sắc và dung mụi hũa tan chỳng

STT Ion kim loại

Phức chất với thiosemicacbazon isatin Dung mụi Hoà tan Ký hiệu Màu sắc

1 Cu2+ Cu(thisa)2 Đen Axeton, DMF, CHCl3… 2 Zn2+ Zn(thisa)2 Vàng Axeton, DMF, CHCl3… 3 Ni2+ Ni(thisa)2 Đỏ nõu Axeton, DMF, CHCl3… 4 Pd2+ Pd(thisa)2 Đỏ gạch Axeton, DMF, CHCl3… 2.3. ĐIỀU KIỆN GHI PHỔ

Phổ hấp thụ hồng ngoại (IR) của cỏc chất đƣợc ghi trờn mỏy quang phổ FR/IR 08101 trong vựng 4000-400cm-1 của hóng Shimadzu tại Viện Hoỏ Học, Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam. Mẫu đƣợc chế tạo theo phƣơng phỏp ộp viờn với KBr.

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhõn: 1

H, 13C của cỏc chất đƣợc ghi trờn mỏy Bruker- 500MHz ở 300K, trong dung mụi d6-DMSO và CDCl3, tại Viện Hoỏ học - Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.

Phổ khối lƣợng (MS) của cỏc phức chất đƣợc ghi trờn mỏy LC-MSD- Trap-SL tại Phũng cấu trỳc, Viện Hoỏ học, Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam với điều kiện nhƣ sau: vựng đo m/z: 50 - 2000; ỏp suất phun mự 30 psi; tốc độ khớ làm khụ 8 lớt/phỳt; to

làm khụ 325oC; tốc độ thổi khớ 0,4ml/phỳt; chế độ đo possitive, theo phƣơng phỏp ESI.

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.4. PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG KIM LOẠI

Để xỏc định hàm lƣợng kim loại trong cỏc phức chất, chỳng tụi tiến hành vụ cơ húa mẫu, sau đú sử dụng phƣơng phỏp chuẩn độ complexon (đối với Cu2+

, Zn2+, Ni2+) và phƣơng phỏp phõn tớch trọng lƣợng (đối với Pd2+

). Cỏch tiến hành cụ thể nhƣ sau: Cõn một lƣợng chớnh xỏc mo gam mẫu trong khoảng 0,03 - 0,05 gam, chuyển vào bỡnh Kenđan. Thấm ƣớt mẫu bằng vài giọt H2SO4 đặc rồi đun trờn bếp điện. Để nguội một ớt, rồi nhỏ vào đú 2 ml dung dịch H2O2 30%, tiếp tục đun cho tới khi cú khúi trắng thoỏt ra. Lặp lại cụng đoạn nhƣ vậy cho tới khi mẫu tan hết.

2.4.1. Phõn tớch hàm lƣợng đồng

Sau khi vụ cơ húa phức chất Cu(thisa)2 , thu đƣợc dung dịch Cu2+ trong suốt cú màu xanh. Để nguội dung dịch rồi chuyển vào bỡnh định mức 50 ml và thờm nƣớc tới vạch mức . Hỳt 10ml dung dịch Cu(II) vào bỡnh nún 100 ml, điều chỉnh mụi trƣờng bằng dung dịch NH3 loóng tới pH = 8, thờm chỉ thị murexit (dung dịch cú màu vàng nhạt) rồi chuẩn độ bằng dung dịch EDTA nồng độ C mol/l cho tới khi dung dịch chuyển sang màu tớm. Thể tớch dung dịch EDTA tiờu tốn là V ml. Hàm lƣợng Cu trong mẫu đƣợc tớnh theo cụng thức sau: %mCu= V x C x 64 50 10 1000 x mo x 100 % 2.4.2. Phõn tớch hàm lƣợng kẽm

Sau khi vụ cơ húa phức chất Zn(thisa)2 thu đƣợc dung dịch trong suốt khụng màu. Để nguội dung dịch thu đƣợc, sau đú chuyển vào bỡnh định mức 50 ml và thờm nƣớc tới vạch mức. Hỳt 10ml dung dịch Zn(II) vào bỡnh nún 100 ml, điều chỉnh mụi trƣờng bằng dung dịch NH3 loóng tới pH = 10, thờm chỉ thị ET-OO (dung dịch cú màu đỏ nho) rồi chuẩn độ bằng dung dịch

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

EDTA nồng độ C mol/l cho tới khi dung dịch chuyển sang màu xanh biếc. Thể tớch dung dịch EDTA tiờu tốn là V ml. Hàm lƣợng Zn trong mẫu đƣợc tớnh theo cụng thức sau: %mZn = V x C x 65 50 10 1000 x mo x 100 % 2.4.3. Phõn tớch hàm lƣợng niken

Sau khi vụ cơ húa phức chất Ni(thisa)2 , thu đƣợc dung dịch trong suốt cú màu xanh. Để nguội dung dịch thu đƣợc, sau đú chuyển vào bỡnh định mức 50 ml và pha nƣớc tới vạch mức. Hỳt 10ml dung dịch Ni(II) vào bỡnh nún 100 ml, điều chỉnh mụi trƣờng bằng dung dịch NH3 loóng tới pH = 8, thờm chỉ thị murexit (dung dịch cú màu vàng nhạt) rồi chuẩn độ bằng dung dịch EDTA nồng độ C mol/l tới khi dung dịch chuyển sang màu tớm. Thể tớch dung dịch EDTA tiờu tốn là V ml. Hàm lƣợng Ni trong mẫu đƣợc tớnh theo cụng thức sau:

Ni o 50 V C 58 10 %m 100% 1000 m       2.4.4. Phõn tớch hàm lƣợng palađi

Để xỏc định hàm lƣợng của palađi trong phức chất chỳng tụi sử dụng phƣơng phỏp phõn tớch trọng lƣợng bằng cỏch kết tủa palađi(II) bằng đimetylglyoxim.

Sau khi vụ cơ húa Pd(thisa)2 thu đƣợc dung dịch cú màu vàng nhạt. Để nguội dung dịch thu đƣợc, sau đú chuyển vào cốc và pha loóng thành 50ml. Chỉnh mụi trƣờng bằng dung dịch NH3 loóng cho tới khi pH = 2 - 4. Thờm vào đú từng giọt dung dịch đimetylglyoxim (1,5% trong etanol) tới khi khụng thấy kết tủa mới xuất hiện, thờm tiếp 5ml nữa để đảm bảo dƣ đimetylglyoxim. Kết tủa đƣợc để lắng qua đờm sau đú lọc bằng phễu lọc thuỷ tinh xốp (cú khối lƣợng ban đầu m1 gam (sau khi sấy ở 120o trong 10 giờ)). Sau đú, sấy phễu

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

chất ở 120o (trong 10 giờ). Cõn tổng khối lƣợng phễu lọc và kết tủa (m2 gam). Tớnh đƣợc lƣợng Pd cú trong mẫu ban đầu theo cụng thức:

2 1 Pd o (m m ) 0,316 %m = 100% m   

trong đú giỏ trị 0,316 là hàm lƣợng % theo khối lƣợng của palađi trong phức chất của nú với đimetylglyoxim.

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

Chƣơng 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG KIM LOẠI TRONG CÁC PHỨC CHẤT PHỨC CHẤT

Sau khi tiến hành phõn tớch hàm lƣợng ion kim loại trong phức chất và tớnh toỏn theo cụng thức giả định chỳng tụi thu đƣợc bảng kết quả sau:

Bảng 3.1: Kết quả phõn tớch hàm lượng kim loại

trong cỏc phức chất

STT Phức chất Hàm lƣợng ion kim loại Cụng thức giả định LT(%) TN(%)

1 Cu(thisa)2 12,75 12,81 C18H14N8O2S2Cu 2 Zn(thisa)2 12,92 12,85 C18H14N8O2S2Zn 3 Ni(thisa)2 11,69 11,73 C18H14N8O2S2Ni 4 Pd(thisa)2 19,49 19,52 C18H14N8O2S2Pd

Kết quả phõn tớch hàm lƣợng của cỏc kim loại trong phức chất và tớnh toỏn theo cụng thức giả định khỏ phự hợp nhau. Điều này cho thấy cụng thức giả định của cỏc phức chất đƣa ra là hoàn toàn hợp lý. Cụng thức giả định của cỏc phức chất sẽ đƣợc khẳng định tiếp khi chỳng tụi nghiờn cứu cấu tạo của phối tử và cỏc phức chất bằng cỏc phƣơng phỏp vật lý hiện đại ở cỏc phần tiếp theo.

3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PHỔ KHỐI LƢỢNG CỦA CÁC PHỨC CHẤT

3.2.1. Phổ khối lƣợng của phức chất Cu(thisa)2

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hỡnh 3.1: Phổ khối lượng của phức chất Cu(thisa)2

Trờn phổ khối lƣợng của phức chất Cu(thisa)2 xuất hiện pic cú cƣờng độ lớn, với trị số là m/z = 502. Giỏ trị này ứng đỳng bằng khối lƣợng phõn tử của phức chất sau khi đó bị proton húa [M + H]+. Đõy chớnh là pớc ion phõn tử của phức nghiờn cứu. Ở vựng m/z > 502 khụng xuất hiện pic nào, chứng tỏ trong điều kiện ghi phổ phức chất ở trạng thỏi đơn nhõn và khụng bị polyme hoỏ.

Để khẳng định thờm về cụng thức phõn tử của phức chất chỳng tụi tiến hành tớnh toỏn cƣờng độ tƣơng đối của cỏc pic đồng vị trong cụm pic ion phõn tử của phức chất Cu(thisa)2 bằng phần mềm tớnh toỏn online isotope distribution caculator cho cụng thức giả định là C18H14N8O2S2Cu. Kết quả tớnh toỏn này đƣợc so sỏnh với cƣờng độ tƣơng đối đối của cỏc pic đồng vị trong cụm pic ion phõn tử của phức chất Cu(thisa)2 thu đƣợc trờn phổ khối lƣợng của nú. Kết quả đƣợc trỡnh bày trong bảng 3.2

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 3.2: Cường độ tương đối của cỏc pic đồng vị trong cụm pic ion

phõn tử của phức chất Cu(thisa)2 C18H14N8O2S2Cu m/z Cƣờng độ tƣơng đối Lý thuyết Thực tế 501 100 100 502 24,24 16,88 503 56,66 34,37 504 13,19 9,96 505 5,92 4,96 506 1,14 2,81 507 0,25 0,18

Trờn biểu đồ trờn, cú thể nhận thấy sự sai lệch về cƣờng độ tƣơng đối giữa lý thuyết và thực tế trong cụm pic đồng vị là tƣơng đối nhỏ. Nhƣ vậy một lần nữa khẳng định cụng thức giả định của phức chất đó đƣa ra là đỳng.

3.2.2. Phổ khối lƣợng của phức chất Zn(thisa)2

Phổ khối lƣợng của phức chất Zn(thisa)2 đƣợc đƣa ra trờn hỡnh 3.2

Hỡnh 3.2. Phổ khối lượng của phức chất Zn(thisa)2

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Cƣờng độ 501 502 503 504 505 506 507 m/z Lý thuyết Thực tế

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

Trờn phổ khối lƣợng của phức chất Zn(thisa)2 thấy xuất hiện tớn hiệu cú tần suất lớn nhất, cú trị số m/z = 503 ứng với ion phõn tử đó bị proton hoỏ [M+H]+. Điều này cú thể khẳng định trong điều kiện ghi phổ phức chất tồn tại ở trạng thỏi đơn nhõn, cụng thức phõn tử của phức là C18H14N8O2S2Zn.

Tỷ lệ cƣờng độ tƣơng đối của cụm pic đồng vị trong cụm pic ion phõn tử của phức chất giữa lý thuyết và thực tế đƣợc liệt kờ trong bảng 3.3. Trong đú giỏ trị thực tế thu đƣợc từ phổ khối lƣợng của phức chất Zn(thisa)2 và giỏ trị lý thuyết tớnh theo phõn tử C18H14N8O2S2Zn.

Bảng 3.3: Cường độ cỏc pic đồng vị trong cụm pic ion phõn tử

của phức chất Zn(thisa)2 C18H14N8O2S2Zn m/z Cƣờng độ tƣơng đối Lý thuyết Thực tế 502 100 100 503 24,24 25,51 504 69,49 71,95 505 24,74 14,4 506 48,2 44,36 507 11,85 14,95 508 6,43 4,08 509 1,31 1,92

Từ biểu đồ, cú thể thấy sự phự hợp giữa giỏ trị lý thuyết và thực tế. Điều này cho phộp khẳng định cụng thức giả định của phức chất này là đỳng.

3.2.3. Phổ khối lƣợng của phức chất Ni(thisa)2

Phổ khối lƣợng của phức chất Ni(thisa)2 đƣợc đƣa ra trờn hỡnh 3.3

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Cƣờng độ 502 503 504 505 506 507 508 509 m/z Lý thuyết Thực tế

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hỡnh 3.3: Phổ khối lượng của phức chất Ni(thisa)2

Trờn phổ khối lƣợng của phức chất xuất hiện pic cú trị số đỳng bằng trị số khối lƣợng của phức chất sau khi đó bị proton húa [M +H]+

ở 497. Chứng tỏ phức chất này là phức đơn nhõn và bền trong điều kiện ghi phổ. Việc so sỏnh cƣờng độ tƣơng đối của cỏc pic đồng vị trong cụm pic ion phõn tử của phức chất thu đƣợc từ phổ khối lƣợng và sử dụng phần mềm tớnh toỏn online ỏp dụng cho phõn tử phức chất C18H14N8O2S2Ni cho kết quả ở bảng 3.4

Bảng 3.4: Cường độ tương đối của cỏc pic đồng vị trong cụm pic ion

phõn tử của phức chất Ni(thisa)2 C18H14N8O2S2Ni m/z Cƣờng độ tƣơng đối Lý thuyết Thực tế 496 100 100 497 24,24 25,52 498 50,31 39,91 499 13,31 15,16 500 10,81 8,66 501 2,47 2,62 502 2,22 1,49 503 0,49 1,79

Qua biểu đồ cho thấy cỏc giỏ trị về cƣờng độ cỏc pic đồng vị giữa lý thuyết và thực tế là tƣơng đồng. Điều này cho phộp khẳng định cụng thức phõn tử giả định của phức chất này là đỳng.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Cƣờng độ 496 497 498 499 500 501 502 503 m/z Lý thuyết Thực tế

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

3.2.4. Phổ khối lƣợng của phức chất Pd(thisa)2

Phổ khối lƣợng của phức chất Pd(thisa)2 đƣợc đƣa ra trờn hỡnh 3.4

Hỡnh 3.4: Phổ khối lượng của phức chất Pd(thisa)2

Tớn hiệu cú tỉ số m/z = 545 trựng với trị số khối lƣợng phõn tử phức chất đó bị proton húa [M+H]+

.

Việc so sỏnh cƣờng độ tƣơng đối của cỏc pic trong cụm pic ion phõn tử thu đƣợc trờn phổ với kết quả tớnh toỏn tớnh toỏn lớ thuyết cho phõn tử

C18H14N8O2S2Pd thu đƣợc bảng 3.5

Bảng 3.5: Cường độ cỏc pic đồng vị trong cụm pic ion

phõn tử của phức chất Pd(thisa)2 C18H14N8O2S2Pd m/z Cƣờng độ tƣơng đối