i u ki n BA CA SS MC Phân * * 350C-370C N c ti u * * 350C-370C Máu * * Bình n n (BA), 350C-370C D ch não t y * * Bình n n, 350C-370C D ch c th , m , đƠm, d ch đ ng hô h p * * Bình n n (BA) 350C-370C
: Sau khi c y xong đ vào t m nhi t đ 370C, t 18-24 gi .
Các m u b nh ph m d ch não t y, m , máu đ c c y trên môi tr ng BA ph i v ch satellite (đ ng SAU).
Khi tùy lo i b nh ph m vƠ môi tr ng mà t 5% CO2 hay t m bình th ng.
K t qu :
N u vi khu n m c c n ti n hƠnh xác đnh có ph i là t p nhi m hay không, n u không thì ti p t c đ nh danh vi khu n (có th có nhi u lo i vi khu n khác nhau c n đnh danh t t c các lo i khúm khác nhau).
2.2.2.2 Ph ng ph́p c y đ nh l ng
Nguyên t c: Dùng đ c y m u b nh ph m lƠ n c ti u. n v tính th ng là CFU/ml. Dùng que c y đ nh l ng đ c y, 1 vòng que c y t ng đ ng v i 1/103ml.
Thao tác:
Kh trùng que c y. M n p l , kh trùng mi ng l đ ng m u. Làm ngu i que c y l y 1 vòng m u c y.
Kh trùng l i mi ng l vƠ đ y n p l l i.
M t tay m n p đ a petri m t tay b t đ u c y trên m t th ch theo ki u c y hàng rào.
: Sau khi c y hƠng rƠo trên môi tr ng BA, MC vào t m nhi t đ 370C, t 18-24 gi .
K t qu : Khi vi khu n m c trên 10 khúm thì ti p t c đ nh danh vi khu n (khi trên môi tr ng có nhi u lo i khúm ta có th xác đnh là t p khu n).
2.2.3 Quy trình đ nh danh:
2.2.3.1 H th ng đ nh danh
đnh danh vi khu n Escherichia coli ta d a vƠo s đ đnh danh tr c khu n Gram ơm nh sau. [23]
S NH DANH TR C KHU N GRAM ÂM
Test sinh hóa (KIA, SIM, CIT, Oxidase)
Enterobacteriaceae Glucose(+) (KIA) Oxidase (-)
Non-Enterobacteriaceae (Non fermentative Gram negative bacilli)
Glucose (-) Oxidase (+)/(-) Không m c trên MC
B ng tr c nghi m sinh hóa đnh danh tr c khu n Gram (-)
API 20NE Pseudomonas aeruginosa (Pae) MC (+); CIT(+); Oxidase(+). BA: khúm l n, biên ko đ u, ph ng/ h i l i, tiêu huy t , có mùi th m nh . MHA: s c t xanh/ vƠng, mùi th m nh . KIA: Glu(-), Lact(-),
ánh xám b c b m t môi tr Acinetobacter spp. MC: (+) KIA: Glu (-), Lact: (-) SIM: Ind (-), H2S (-), di đ ng (-) CIT (+) Oxidase (-) API 20NE
B ng 2.3: B ng tr c nghi m sinh hóa đ nh danh tr c khu n Gram âm. [21]
Ghi chú:
Yersiniae enterolitica không di đ ng 360C nh ng di đ ng 220C.
2.2.3.2 Ph ng ph́p nhu m Gram. [16, 23, 28]
Nguyên t c:
S b t màu Gram khác nhau vi khu n Gram d ng vƠ Gram ơm lƠ do tính th m th u khác nhau đ i v i ethanol c a hai nhóm vi khu n đó. N u dùng lysozyme bi n đ i vi khu n Gram d ng thƠnh protoplast không có vách thì protoplast l i b t màu Gram âm. Vi khu n Gram d ng có thƠnh t bào dày t 15 đ n 50 nm, d ng l i, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Vi khu n KIA, sinh h i H2S IND CIT Ure di đ ng
Escherichia coli L+/G+ + - + - - + Shigella spp. (A,B,C) L-/G+ - - -/+ - - - Shigella sonnei L-/G+ - - - - Edwardsiella tarda L-/G+ + + + - - + Salmonella spp. L-/G+ + + - + - + Citrobacter freundii L+/G+ + + + - + +/- Citrobacter koseri L-/G+ + - + + +/- + Klebsiella pneumoniae L+/G+ ++ - - + + - Klebbsiella oxytoca L+/G+ ++ - + + + - Enterobacter aerogenes L+/G+ ++ - - + - + Enterobacter cloacae L+/G+ ++ - - + +/- + Serratia marcescens L-/G+ + - - + - + Proteus vulgaris L-/G+ +/- + + -/+ + + Proteus mirabilis L-/G+ + + - +/- + + Providencia rettgeri L-/G+ - - + + ++ + Morganella morganii L-/G+ + - + - ++ - Yersiniae enterolitica L-/G+ + - +/- - +/- -
c u t o b i peptidoglycan. Ch t này có kh n ng gi ph c h p tím k t tinh - lugol. Trong khi đó, l p thành t bào peptidoglycan c a các vi khu n Gram âm thì m ng h n vƠ th ng có thêm l p màng lipopolysaccharde (LPS). Sau khi nhu m v i ph c h p tím k t tinh - lugol, m u đ c x lí ti p v i h n h p kh màu, làm m t n c c a các l p peptidoglycan trong thành t bƠo Gram d ng, t đó lƠm gi m kho ng tr ng gi a các phân t và khi n thành t bào b t gi ph c h p tím k t tinh ậ lugol bên trong t bào.
i v i vi khu n Gram âm, h n h p kh mƠu đóng vai trò lƠ ch t hoà tan lipit và làm tan màng ngoài c a thành t bào. L p peptidoglycan m ng (ch kho ng 10 nm) không th gi l i ph c h p tím k t tinh ậ lugol và t bào Gram âm b kh màu và b t màu thu c nhu m b sung.
D ng c và thu c nhu m: D ng c : Khuyên c y khu n èn c n (đèn gas) Kính đ ng v t (lame) s ch Bút chì m BHI ng h phút Thu c nhu m:
Dung d ch Crystal Violet Dung d ch Iodine (Lugol) C n 95%
Dung d ch Safranin 0,5% hay dung d ch Carbol Fuchsin 1/10 Methylen blue
Ngu n: nh ch p t i b nh vi n
Hình 2.21 B thu c nhu m Gram và nhu m phân
Các b c ti n hành
H nhanh tiêu b n qua ng n l a đèn c n
Dùng bút chì m ho c bút lông ghi tên m u và s th t , và v vòng tròn d= 15mm trên lame kính đ đánh d u v t khu n.
B c 1: Chu n b v t bôi: Dùng que c y vô trùng l y m t ít b nh ph m đ gi a phi n kính, làm khô trong không khí.
M u th làm phi n ph t
T b nh ph m
N u b nh ph m là m hay các ch t ngo i ti t t ng đ ng: lƠm m t ph t m ng v i khuyên c y đư kh trùng, tr i đ u trên t m kính trên m t di n tích 1,5 × 2,5 cm.
N u b nh ph m đ c l y b ng que gòn: Dùng que gòn làm phi n ph t th ng ho c làm huy n tr c v i 1 gi t n c mu i n u b nh ph m đư khô.
N u b nh ph m lƠ đƠm hay phơn: Ch n ph n có m hay máu.
N u là b nh ph m l ng nh n c ti u, n c t y s ng: Làm phi n ph t t c n l ng li tâm v i ng hút có đ ng kính nh .
T l a c y:
N u là l a c y l ng: Tùy theo đ đ c c a l a c y, ta l y m t gi t nh hay l y đ y 2,3 khuyên c y khu n đ làm phi n ph t.
N u là l a c y trên môi tr ng đ c: dùng khuyên c y khu n ch m trên 1 nhóm vi khu n riêng l , làm huy n tr c trong 1 gi t n c mu i trên kính, xong tr i m ng thành phi n ph t. Nên phơn tán đ u không dày đ có th quan sát đ c t ng t bào vi khu n.
K thu t làm phi n ph t
C m que c y th t th ng đ ng, đ u khuyên đ t trên ng n l a đèn c n vƠ đ t đ đ u que c y.
ngu i, l y 1 khuyên đ y b nh ph m.
t khuyên b nh ph m vào gi a t m kính, cho áp sát vào m t kính, ph t đ u trên kính thành nh ng hình b u d c v i di n tích 1,5 × 2,5 cm.
t đ đ u que c y đ kh khu n.
B c 2: C đnh tiêu b n vi khu n:
Phi n ph t đ c đ khô t nhiên trong không khí, ho c h nh trên ng n đèn. Sau đó l u đnh phi n ph t b ng cách đ a nhanh t m lame qua l i trên ng n l a đ 4 - 5 l n, đ m t có phi n ph t phía trên. Không đ c h nóng quá vì s làm các t bào co l i. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
B c 3: Nhu m
Ph dung d ch Crystal Violet (tím k t tinh) lên phi n ph t trong 1 phút, r a n c và nghiêng lame cho ráo.
Ph dung d ch lugol l n I đ 30 giơy, đ b và r a n c r i nghiêng lame cho ráo.
nghiêng phi n lame 450C, t y màu b ng dung d ch alcohol 95% cho đ n khi gi t cu i cùng ch y ra kh i phi n kính không còn mƠu (thông th ng kho ng 10 - 30 giây) thì r a n c, th m khô. ơy lƠ b c quan tr ng nh t.
Nhu m b sung b ng dung d ch Safranin trong 1 phút, r a n c, đ khô trong không khí.
B c 4: Soi kính: S d ng d u soi kính và v t kính d u đ quan sát
Ngu n: Internet
Hình 2.22: K t qu nhu m Gram c a B- và C+
Ngu n: nh ch p t i b nh vi n
Hình 2. 23 T bào bi u mô Hình 2.24 T bào b ch c u
Vi khu n Gram (+): gi màu tím c a Crystal Violet. Vi khu n Gram (-): gi mƠu đ c a Safranin.
M t s sai sót trong k t qu nhu m Gram Gram (+) có th tr thành Gram (-)
Do s t h y, t ng tính acid c a môi tr ng, nhi t đ c y không thích h p, s hi n di n c a m t s đ c ch t. Do đó mu n đ c chính xác ph i nhu m Gram v i l a c y t 18-24 gi .
Khi dung d ch indol đư h ng. Vì th ph i gi dung d ch Indol trong chai nâu, tránh ánh sáng và lo i b khi dung d ch t màu nâu s m đ i sang màu vàng nh t
T y màu quá lâu
Có th nh m l n Gram (-) là Gram (+), n u: Phi n đ c l u đ nh khi ch a khô.
Phi n ph t quá d y, vi khu n phơn tán không đ u, t p trung quá nhi u m t ch và có th gi màu tím khi t y màu.
Th i gian t y quá ít.
2.2.3.3 Th nghi m kh́ng sinh đ theo ph ng pháp Kirby-Bauer. [11,15,23]
Nguyên t c
Kháng sinh đ c t m vƠo đ a gi y theo n ng đ cho t ng lo i.Thu c kháng sinh th m trên đ a, khu ch tán ra môi tr ng xung quanh đ a ng n ch n s phát tri n c a vi khu n. ng kính vòng vô khu n di n đ t tính c m ng c a vi khu n đ i v i thu c kháng sinh, tr ng h p không có vòng vô khu n, vi khu n kháng l i thu c kháng sinh.
B ng 2.4 : Tiêu chu n đ ng kính vòng vô khu n vi khu n đ ng ru t (Enterobacteriaceae)
a kháng sinh:
Là nh ng đ a gi y th m có b dƠy 1 mm, đ ng kính 6 mm đ c t m m t dung d ch thu c kháng sinh v i n ng đ tiêu chu n. a kháng sinh ph i đ c gi t l nh, có kèm theo ch t lƠm khan n c, ch ng m s c nóng và s ngo i nhi m làm h ng đ a.
STT A KHÁNG SINH HÀM L NG NG KÍNH VÒNG VÔ KHU N Kháng (R) Trung gian (I) Nh y (S) 1 Ampicillin 10 µg ≤ 13 14 - 16 ≥ 17 2 Amikacin 30 µg ≤ 14 15 - 16 ≥ 17 3 Cefotaxime 30 µg ≤ 14 15 - 22 ≥ 23 4 Ceftazidime 30 µg ≤ 14 15 - 17 ≥ 18 5 Ceftriazone 30 µg ≤ 13 14 - 20 ≥ 21 6 Cefuroxime (oral) 30 µg ≤ 14 15 - 22 ≥ 23 7 Chloramphenicol 30 µg ≤ 12 13 - 17 ≥ 18 8 Ciprofloxacin 5 µg ≤ 15 16 - 20 ≥ 21 9 Bactrim 1.25/23.75 µg ≤ 10 11 - 15 ≥ 16 10 Gentamicin 10 µg ≤ 12 13 - 14 ≥ 15 11 Nalidixic acid (*) 30 µg ≤ 13 14 - 18 ≥ 19 12 Nitrofurantoin (*) 300 µg ≤ 14 15 ậ 16 ≥ 17 13 Norfoxacin (*) 10 µg ≤ 12 13 - 16 ≥ 17 14 Polymycin B 100 UI - - ≥ 17 15 Imipenem 10 µg ≤ 13 14 -15 ≥ 16 16 Cefepime 30 µg ≤ 14 15 - 17 ≥ 18 17 Pefloxacine 5 µg ≤ 15 16 - 20 ≥ 21 18 Ticarcillin 75 µg ≤ 14 15 - 19 ≥ 20 19 Meropenem 10 µg ≤ 13 14 - 15 ≥ 16 20 Aztreonam 30 µg ≤ 15 16 - 21 ≥ 22
Các tiêu chu n l a ch n kháng sinh th nghi m đ c h ng d n chi ti t b i y ban Qu c gia v tiêu chu n c a các phòng thí nghi m t i M . Các tiêu chu n chính:
Ch n kháng sinh đ i di n cho nhóm có cùng ph ho t đ ng Tùy thu c vào lo i vi khu n th nghi m
Tùy thu c vào v trí nhi m khu n
Tùy theo chi n l c và chính sách s d ng kháng sinh t ng vùng, t ng b nh vi n.
Môi tr ng: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Môi tr ng tiêu chu n là MHA, pH: 7,4. V i các vi khu n khó tính ph i cho thêm 5% máu.
Môi tr ng đ c đ vƠo đ a petri v i b dày c a th ch là 4 mm. B o qu n t l nh không đ c dùng sau 7 ngƠy. Tr c khi dùng, ph i l y ra kh i t l nh và đ cho đ n khi đ t đ c nhi t đ phòng.
Dung d ch chu n đ đ c (huy n d ch t ng đ ng đ đ c khu n 1 - 2.108 CFU/ml)
Vi khu n th nghi m:
Vi khu n sau khi đư đ c c y thu n khi t, c y vào ng 2 ậ5 ml môi tr ng BHI, sau đó vortex thƠnh m t huy n d ch vi khu n đ ng nh t theo đ đ c chu n.
K thu t (ph ng pháp)
Dùng que gòn nhúng vào canh c y đư đ c chu n đ đ c, ép h t n c trên thành ng nghi m, xong tr i th t đ u lên m t th ch. 5 - 10 phút nhi t đ phòng đ lo i b vi khu n th a.
Dùng k p h l a, đ ngu i g p đ a thu c kháng sinh đ lên m t th ch, đè nh cho đa n m sát đ có s ti p xúc tr n v n v i m t th ch, bìa các đ a ph i cách xa nhau 2,5 - 3,5 cm và cách thành h p th ch 2 - 2,5 cm.
370C vƠ đ c k t qu sau 24 gi .
c k t qu b ng cách đo đ ng kính vòng vô khu n r i so v i b ng chu n.
Ph ng pháp phát hi n vi khu n ti t men betalactamse ph r ng:
Ph ng ph́p th nghi m ESBLs (ph ng ph́p đ a hi p đ ng kép)
H p th ch MHA 1: đ t 5 khoanh gi y kháng sinh nh ng v trí có ch ý: ATM gi a
CTX, CRO, CAZ, CPD đ t xung quanh cách ATM 30 mm và các khoanh gi y kháng sinh cách nhau 30 mm.
H p th ch MHA 2: đ t 4 khoanh gi y kháng sinh nh ng v trí có ch ý: Ceftazidime-Clavulanic acid , Ceftazidime
Cefotaxime-Clavulanic acid , Cefotaxime M i khoanh gi y kháng sinh cách nhau 30 mm.
Cách đ c k t qu th nghi m phát hi n men ESBLs:
Nghi ng vi khu n có ti t men ESBLs.
Ch c n 2 trong 4 lo i kháng sinh CPD, CTX, CAZ, ATM có đ ng kính vòng vô khu n b ng ho c nh h n vòng vô khu n kho ng trung gian.
Kh ng đ nh vi khu n có ti t men ESBLs.
Khi s chênh l ch đ ng kính vòng kháng khu n ≥ 5mm c a 2 c p gi y kháng sinh CTX/CCTX và CAZ/CCAZ.
3 K T QU NGHIểN C U VẨ BI N LU N Các k t qu đ c trích t ph n m m x lỦ WHONET vƠ đ c x lý l i b ng Word và Excel. 3.1 K t qu t l nhi m khu n Trong 6 tháng t 01/10/2013 đ n 31/03/2014 khoa ti p nh n 11476 m u b nh ph m (6073 m u máu, 3224 m u DNT và m u m , 585 m u phân, 579 m u n c ti u