2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CÂY Ô MÔI
3.2.2.Phương pháp sắc ký cột
Sử dụng phương pháp sắc ký cột hấp thu (Absorption chromatography). Pha động là chất lỏng, pha tĩnh là chất rắn. Ở phương pháp sắc ký này, các chất của hỗn hợp sẽ hấp thu hoặc dính lên bề mặt của pha tĩnh. Các chất khác nhau sẽ có những mức độ hấp thu khác nhau lên pha tĩnh và chúng cũng phụ thuộc vào tính chất của pha động. Kết quả là trong quá trình pha động di chuyển qua pha tĩnh, chúng sẽ tách nhau ra.
Sự hấp thu xảy ra là do sự tương tác lẫn nhau giữa các phân tử phân cực, do sự tương tác giữa những phân tử có mang những nhóm phân cực đối với pha rắn là chất rất phân cực. Trong sắc ký cột hấp thu pha rắn thường là những hạt silica gel. Trên bề mặt những hạt này có mang nhiều nhóm –OH nên đây là pha tĩnh có tính rất phân cực.
Luận văn: Góp phần khảo sát thành phần hóa học vỏ cây ô môi Cassia grandis
Nguyễn Tuấn Vũ 23
Chương 2
THỰC NGHIỆM
1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 1.1. NGUYÊN LIỆU
1.1.1. THU HÁI NGUYÊN LIỆU
Mẫu thực vật được dùng trong đề tài là vỏ cây ô môi được thu hái ở huyện Vĩnh Lợi, tỉnh Bạc Liêu và huyện Tân Trụ, tỉnh Long An.
Thời gian thu hái: tháng 07/2012.
1.1.2. XỬ LÝ MẪU NGUYÊN LIỆU
Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy lại ở 60oC. Vỏ cây ô môi sau khi sấy được xay thành bột mịn. Đây là nguyên liệu dùng trong đề tài.
Luận văn: Góp phần khảo sát thành phần hóa học vỏ cây ô môi Cassia grandis
Nguyễn Tuấn Vũ 24
1.2. HÓA CHẤT
Ethanol 99o, Việt Nam
Silica gel 200 – 400 mesh, Ấn Độ
n-hexan, Trung Quốc
Methanol, Trung Quốc và Việt Nam
Chloroform, Trung Quốc
Ethyl acetate, Trung Quốc và Việt Nam
Petroleum ether, Trung Quốc và Việt Nam
Na2SO4 khan, Trung Quốc
H2SO4 98%, d = 1.84 g/ml, Trung Quốc
Xăng cao su, Việt Nam
1.3. THIẾT BỊ
Máy cô quay chân không R – 210
Bản silica gel 60 F254, MERCK tráng sẵn
Đèn UV: MINERALIGHT® LAMP, U.S.A
Bình phun xịt thuốc thử
Tủ hút MEMMERT Máy sấy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cân phân tích GR-200 và cân kỹ thuật GM 612
Bếp điện dùng để nướng bản mỏng Blacker®
Các loại cột sắc ký
Dụng cụ thủy tinh:
Phễu lọc
Bình sắc ký
Ống nghiệm, đũa thủy tinh
Cốc 100ml, 250ml, 500ml
Bình lóng 1000 ml
Ống đong 10 ml, 100 ml, 500 ml
Erlen 100ml, 250ml, 500ml
Luận văn: Góp phần khảo sát thành phần hóa học vỏ cây ô môi Cassia grandis
Nguyễn Tuấn Vũ 25
2. ĐỊNH TÍNH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA VỎ CÂY Ô MÔI[7] 2.1. KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT STEROID 2.1. KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT STEROID
Cân 1g bột khô, cho vào 20ml CHCl3 và ngâm trong 2 giờ. Sau đó lọc lấy dịch trong là mẫu thử.
Thuốc thử:
- Salkowsky: H2SO4đđ (1ml)
- Libermann-Burchard: (CH3CO)2O (20ml), H2SO4đđ (1ml)
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch mẫu, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt đến hết 1ml các thuốc thử theo thành ống nghiệm. Để yên quan sát.
- Thuốc thử Salkowsky: Nếu dung dịch có màu đỏ đến nâu đỏ là dương tính.
- Thuốc thử Libermann-Burchard: Nếu thấy xuất hiện một vòng ngăn cách giữa hai lớp chất lỏng có màu từ hồng đến xanh lá là dương tính.
Hình 2.2: Hiện tượng với thuốc thử Salkowsky và thuốc thử Libermann- Burchard
Luận văn: Góp phần khảo sát thành phần hóa học vỏ cây ô môi Cassia grandis
Nguyễn Tuấn Vũ 26
2.2. KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT FLAVONOID
Đun hoàn lưu 5g bột mẫu trong 50ml EtOH 95% trong 30 phút. Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử.
Thuốc thử: HClđđ + Mgbột + alcol isoamylic, dung dịch (CH3COO)2Pb bão hòa, dung dịch FeCl3 1%.
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch mẫu, thêm vài giọt HClđđ, sau đó cho một ít bột Mg vào và lắc. Thêm từ từ từng giọt alcol isoamylic, để yên quan sát nếu thấy xuất hiện vòng màu hồng hay dung dịch có màu tím thì có flavonoid trong mẫu.
Dung dịch mẫu tạo kết tủa màu xanh lục đen với dung dịch FeCl3 1%, kết tủa trắng với dung dịch (CH3COO)2Pb bão hòa.
Hình 2.3: Hiện tượng với dung dịch FeCl3 và dung dịch (CH3COO)2Pb (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3. KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT ALCALOID
Cân 10 gam bột mẫu ngâm với 60 ml H2SO4 2-5% trong 3-5 giờ. Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử.
Tiến hành cho dung dịch mẫu thử vào các thuốc thử:
- Với thuốc thử Dragendorff cho kết tủa màu từ vàng cam đến đỏ.
Luận văn: Góp phần khảo sát thành phần hóa học vỏ cây ô môi Cassia grandis
Nguyễn Tuấn Vũ 27
- Với thuốc thử Bouchardat cho kết tủa màu nâu hoặc vàng đậm
Hình 2.4: Hiện tượng với thuốc thử Dragendorff, Wagner và Bouchardat
2.4. KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT SAPONIN
2.4.1. DỰA VÀO CHỈ SỐ TẠO BỌT ĐỂ XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN CỦA SAPONIN SAPONIN
Cơ sở của phương pháp: Dược điển của Pháp định nghĩa chỉ số tạo bọt của saponin là độ loãng của nguyên liệu bằng nước để có chiều cao bọt 1cm sau khi lắc trong ống nghiệm có kích thước xác định, tiến hành trong điều kiện quy định.
Cách tiến hành: Cân 1g bột dược liệu cho vào erlen 500ml chứa sẵn 100ml nước sôi. Tiếp tục cho nước trong erlen sôi trong 30 phút nữa. Lọc, để nguội, thêm nước cất cho đến 100ml. Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16cm, đường kính 16mm. Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, 4, 5,..., 10ml dịch lọc. Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ 10ml. Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây. Mỗi giây lắc 2 lần. Để yên trong 15 phút. Sau đó đo chiều cao các cột bọt.
Chỉ số bọt được tính theo công thức: CSB = 100.(10/i) Trong đó: CSB: chỉ số tạo bọt.
Luận văn: Góp phần khảo sát thành phần hóa học vỏ cây ô môi Cassia grandis
Nguyễn Tuấn Vũ 28
Nếu cột bọt trong các ống nghiệm thấp dưới 1cm (tức chỉ số tạo bọt dưới 100) thì coi như không có saponin.
Hình 2.5: Xác định saponin dựa vào chỉ số tạo bọt
2.4.2. DỰA VÀO CÁC PHẢN ỨNG ĐẶC TRƯNG
Cân 5g bột khô, thêm vào 50ml EtOH 70o và đun cách thủy sôi trong 5 phút rồi lọc. Cô cạn dưới áp suất kém đến cặn khô. Cặn khô này dùng làm mẫu thử.
Thuốc thử: Libermann-Burchard: (CH3CO)2O, H2SO4đđ.
Tiến hành: Hòa mẫu bằng 1ml (CH3CO)2O, thêm từ từ 0,3-0,5ml H2SO4đđ. Nếu xuất hiện vòng ngăn cách:
- Có màu hồng đến đỏ tím thì sơ bộ nhận định có saponin triterpenoid.
Luận văn: Góp phần khảo sát thành phần hóa học vỏ cây ô môi Cassia grandis
Nguyễn Tuấn Vũ 29
Hình 2.6: Hiện tượng xác định có saponin triterpenoid.
2.5. KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT TANIN
Cân 5g bột khô, thêm vào 100ml nước cất, đun sôi trong 10 phút. Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử.
Thuốc thử:
- Dung dịch (CH3COO)2Pb: Pha đến bão hòa trong nước.
- Dung dịch FeCl3: Pha nồng độ 1% trong nước. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành: Lấy 2ml dung dịch lọc, thêm 2-4 giọt dung dịch thuốc thử.
- Dung dịch (CH3COO)2Pb: Nếu thấy xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt là dấu hiệu dương tính.
- Dung dịch FeCl3: Nếu dung dịch chuyển thành màu xanh đen hoặc lục đen (do tạo phức) là dấu hiệu dương tính.
Luận văn: Góp phần khảo sát thành phần hóa học vỏ cây ô môi Cassia grandis Nguyễn Tuấn Vũ 30 H ì n h 2 . 7 : H i ệ
Hình 2.7: Hiện tượng với dung dich (CH3COO)2Pb và dung dịch FeCl3
2.6. KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT GLYCOSYDE
Lấy 10g bột khô loại các chất không phân cực bằng PE. Tiếp theo chiết với EtOH 50%. Dịch lọc được loại tạp chất bằng (CH3COO)2Pb cho đến khi không còn trầm hiện. Sau đó loại (CH3COO)2Pb dư bằng Na2SO4 bão hòa. Cô cạn dịch lọc được cao glycosyde thô. Hòa tan cao này bằng EtOH 90% và lấy dung dịch này làm mẫu thử.
Thuốc thử:
- Tollens: dung dịch AgNO3 10% (1ml) + dung dịch NaOH 10% (1ml) + dung dịch NH4OH 25% từ từ từng giọt.
- Fehling:
Dung dịch A: CuSO4.5H2O (40g) + H2O, định mức vừa đủ 1 lít.
Dung dịch B: KNaC4H4O6.4H2O (200g) + NaOH (150g) + H2O, định mức vừa đủ 1 lít.
Luận văn: Góp phần khảo sát thành phần hóa học vỏ cây ô môi Cassia grandis
Nguyễn Tuấn Vũ 31
Khi sử dụng thì trộn hai dung dịch lại với nhau.
Tiến hành: Lấy 1ml mẫu thử, cho vào từng giọt cho đến hết 1ml các thuốc thử.
- Thuốc thử Tollens: Nếu thấy xuất hiện kết tủa màu bạc là dấu hiệu dương tính.
- Thuốc thử Fehling: Đun sôi ống nghiệm trên đèn cồn trong 1 phút. Nếu thấy xuất hiện kết tủa màu đỏ là dương tính.
Hình 2.8: Hiện tượng với thuốc thử Tollens và Fehling
2.7. KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT COUMARINE
Đun hoàn lưu 5g bột mẫu trong 50ml EtOH 95% trong 30 phút. Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử.
Thuốc thử: dung dịch NaOH 10% (0,5ml), HClđđ (vài giọt), H2O (12ml), dung dịch Na2CO3 10% (2ml).
Tiến hành:
- Phản ứng mở vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch thử, thêm vào 1 trong 2 ống 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Đun cả hai ống trên bếp cách thủy đến sôi, lấy ra để nguội, thêm vào mỗi ống 4ml H2O. Nếu chất lỏng trong ống có kiềm trong hơn ống không kiềm có thể xem là dương tính. Tiếp
Luận văn: Góp phần khảo sát thành phần hóa học vỏ cây ô môi Cassia grandis
Nguyễn Tuấn Vũ 32
tục đem acid hóa ống có kiềm với vài giọt HClđđ, nếu dung dịch đang trong suốt lại xuất hiện vẩn đục hoặc kết tủa thì đó là dấu hiệu dương tính.
- Phản ứng diazo hóa: Lấy 2ml mẫu vào ống nghiệm, thêm vào 2ml dung dịch Na2CO3 10% và 4ml H2O. Nếu dung dịch trong ống chuyển sang màu đỏ thẫm là dương tính.
Hình 2.9: Hiện tượng của phản ứng mở vòng lacton và diazo hóa
2.8. KẾT QUẢ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả tổng hợp định tính các nhóm hợp chất có trong trái ô môi được trình bày trong bảng 2.1.
Luận văn: Góp phần khảo sát thành phần hóa học vỏ cây ô môi Cassia grandis
Nguyễn Tuấn Vũ 33
STT HỢP CHẤT THUỐC THỬ HIỆN TƯỢNG KẾT
LUẬN
1 STEROID
Libermann-Burchard Vòng màu nâu +++ Salkowski Màu nâu đỏ +++
2 FLAVONOID
FeCl3 Kết tủa xanh lục ++ (CH3COO)2Pb Kết tủa trắng +
3 ALCALOID
Dragendorff Kết tủa đỏ cam + Wagner Kết tủa nâu sáng + Bouchardat Kết tủa vàng đậm. + 4 SAPONIN Tạo bọt CSB > 100 +++ Libermann-Burchard Màu đỏ tím + 5 TANIN (CH3COO)2Pb Kết tủa vàng nhạt +++ FeCl3 Dung dịch màu xanh +++ 6 GLYCOSYDE
Tollens Kết tủa đen +++ Fehling Kết tủa đỏ ++
7 COUMARINE
Phản ứng mở vòng
lacton Xuất hiện kết tủa ++ Phản ứng diazo hóa Màu đỏ thẫm +
Luận văn: Góp phần khảo sát thành phần hóa học vỏ cây ô môi Cassia grandis Nguyễn Tuấn Vũ 34 Chú thích: + : Dương tính ++ : Dương tính rõ +++ : Dương tính rất rõ - : Âm tính
Qua khảo sát sơ bộ thành phần hóa học hữu cơ, trong vỏ cây ô môi có sự hiện diện của các hợp chất: steroid, flavonoid, alcaloid, saponin, tanin, glycosyde, coumarine.
Các thành phần khác như: acid hữu cơ, carotenoid...vẫn chưa được khảo sát.
3. CÔ LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO THÔ 3.1. ĐIỀU CHẾ CÁC CAO THÔ 3.1. ĐIỀU CHẾ CÁC CAO THÔ
Bột vỏ cây ô môi (17.5kg) được tận trích với 45 lít EtOH 99o bằng phương pháp ngâm dầm, lọc bỏ bã, phần dịch chiết được cô cạn loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao EtOH dạng sệt có khối lượng 450 gam.
Đem cao EtOH chiết lần lượt với các dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần: XCS, EtOAc.
Lọc lấy phần dịch tan sau khi chiết với 7.8 lít XCS đem cô cạn loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao XCS có khối lượng 26 gam.
Phần không tan trong XCS tiếp tục được chiết với 10.5 lít EtOAc. Lọc lấy phần dịch tan sau khi chiết, đem cô cạn loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao EtOAc có khối lượng 45 gam. Phần cao còn lại không tan trong EtOAc có khối lượng 226 gam.
Luận văn: Góp phần khảo sát thành phần hóa học vỏ cây ô môi Cassia grandis
Nguyễn Tuấn Vũ 35
Trong
luận văn này
chúng tôi chỉ khảo
- Chiết với XCS (7.8 lít)
- Cô cạn dưới áp suất thấp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bột vỏ cây ô môi (17.5 kg)
Bã chiết EtOH Cao EtOH
(450 gam)
Phần không tan trong XCS
Cao XCS (26 gam)
Phần không tan trong EtOAc (226 gam)
(22gam)
Cao EtOAc (45 gam)
Sơ đồ 2.1: Quy trình điều chế các cao thô từ vỏ cây ô môi
- Tận trích bằng 45 lít EtOH 990 - Lọc bỏ bã, cô cạn dưới áp suất thấp
- Chiết với EtOAc (10.5 lít)
Luận văn: Góp phần khảo sát thành phần hóa học vỏ cây ô môi Cassia grandis
Nguyễn Tuấn Vũ 36
sát trên cao EtOAc.
3.2. CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ 3.2.1. CÔ LẬP 3.2.1. CÔ LẬP
Tiến hành sắc ký cột
Các thông số cột sắc ký: - Đường kính cột: 5cm
- Khối lượng silica gel 200-400 mesh: 50g - Khối lượng cao EtOAc: 45g
Hệ dung môi giải ly: Xăng cao su – EtOAc (XCS : E) với các tỉ lệ thay đổi theo hướng tăng dần độ phân cực (0% - 100% EtOAc) và cuối cùng là MeOH 100%.
Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng sắc ký bản mỏng, hiện vết bằng đèn UV và bằng cách phun xịt dung dịch axit sunfuric 15% trong EtOH và hơ nóng bản sắc ký trên bếp điện. Quá trình thực hiện được tóm tắt trong bảng 2.2.
Luận văn: Góp phần khảo sát thành phần hóa học vỏ cây ô môi Cassia grandis
Nguyễn Tuấn Vũ 37
Bảng 2.2. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao EtOAc (45g) của vỏ cây ô môi
Tổng lượng cao thu được: 34.3g (Hiệu suất thu hồi cột sắc ký là 76.22%).
Khảo sát phân đoạn CGB5:
Ở phân đoạn CGB5 (từ lọ 151-216) với hệ dung môi XCS:EtOAc = 50:50, sau khi cô cạn thu hồi dung môi và được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, hiện vết bằng đèn UV và bằng dung dịch sunfuric 15% trong EtOH và hơ nóng bản sắc ký. Kết quả cho Cao (45g) Phân đoạn Số lọ Hệ dung môi giải ly cột XCS:EtOAc (ml) Hệ dung môi TLC Kết quả TLC Khối lượng (g) EtOAc CGB1 1-22 100:0 (750) XCS: EtOAc (98:2) Nhiều vết mờ <0.01 CGB2 23-68 98:2 (4500) XCS:EtOAc (95:5) Nhiều vết mờ <0.01 CGB3 69-107 95:5 (3500) C:M (98:2) Nhiều vết mờ <0.01 CGB4 108-150 90:10 (3500) C:M (95:5) Nhiều vết mờ <0.01 CGB5 151-216 50:50 (5500) C:M (85:15) Nhiều vết kéo dài, mờ, trong đó có vài vết tròn đậm. 10 CGB6 217-321 40:60 (12500) C:M (70:30) Nhiều vết đậm kéo dài 8.3 CGB7 322-392 20:80 (6500) C:M (60:40) Có vệt tím kéo dài đậm. 5.6 CGB8 393-468 0:100 (8500) C:M (50:50) Nhiều vết đậm kéo dài 5.8 CGB9 469-493 100% MeOH (1800) C:M (25:75) Nhiều vết kéo dài 4.6 Tổng cộng 34.3
Luận văn: Góp phần khảo sát thành phần hóa học vỏ cây ô môi Cassia grandis
Nguyễn Tuấn Vũ 38
thấy có nhiều vết kéo dài, mờ, trong đó có vài vết tròn đậm. Tổng khối lượng cao ở phân đoạn CGB5 là 10g.
Tiến hành sắc ký cột với phân đoạn CGB5: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các thông số cột sắc ký: - Đường kính cột: 4cm
- Khối lượng silica gel 200-400 mesh: 20g - Khối lượng cao của phân đoạn CGB5: 10g
- Hệ dung môi giải ly: Xăng cao su – EtOAc (XCS : E) với các tỉ lệ thay đổi theo hướng tăng dần độ phân cực (0% - 50% EtOAc) và cuối cùng là MeOH 100%.
Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng sắc ký bản mỏng, hiện vết bằng đèn UV và cách phun xịt dung dịch axit sunfuric 15% trong EtOH và hơ nóng bản sắc ký trên bếp điện. Các phân đoạn giống nhau trên TLC được gom chung lại thành 7 phân đoạn. Quá