M Ở ĐẦU
3.1.2. Tạo dòng vector tái tổ hợp pBSIIK+/Δcrp
Vector tách dòng pBluescript II SK+ có kích thước khoảng 3kb, mang gen kháng kháng sinh Ampicillin và chứa các điểm cắt của các enzyme giới hạn phù hợp với việc chuyển các đoạn gen của gen crp vào. Vector pBSIIK+ được tách chiết bằng bộ Minikit của hãng QIAgen, sau đó được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,2% (hình 3.2A).
Thực hiện phản ứng cắt đoạn gen Pr12 và vector pBSIIK+ bằng cặp enzyme cắt giới hạn BamHI/XbaI. Sau đó tiến hành lai ghép giữa đoạn gen Pr12 và vector pBSIIK+ bằng enzyme T4 ADN ligase, ủ 160C qua đêm. Đoạn gen Pr12 đưa vào vector tách dòng pBSIIK+ tại các vị trí nhận biết của enzyme giới hạn BamHI/XbaI để tạo pBSIIK+/Pr12. Biến nạp vào chủng E.coli JM109 mẫn cảm với Ampicilin và sàng lọc trên môi trường LB chứa kháng sinh Ampicillin.
Vi khuẩn E.coli mọc được trên môi trường có Ampicilin tức là chúng đã nhận được gen kháng ampicilin từ vector pBSIIK+ hay đã biến nạp thành công. Các dòng này được nuôi cấy và kiểm tra sự có mặt của vector pBSIIK+, Pr12.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt ADN plasmid của 4 dòng được sàng lọc bằng enzyme BamHI, XbaI (hình 3.2B) cho thấy cả 4 chủng đều xuất hiện 2 băng: băng 1 kích thước khoảng 3kb tương đương với kích thước của vector pBSIIK+, băng 2 kích thước khoảng 1kb tương đương với kích thước đoạn gen Pr12. Điều này cho thấy đã tạo thành công vector tái tổ hợp pBSIIK+/Pr12.
Vi khuẩn E.coli mang vector tái tổ hợp pBSIIK+/Pr12 được sử dụng để tách chiết ADN plasmid làm nguyên liệu cho thí nghiệm tạo dòng vector tái tổ hợp mang 2 gen Pr12 và Pr34. Sau khi thực hiện phản ứng phân cắt, tiến hành phản ứng lai đoạn gen Pr34 và vector pBSIIK+/Pr12 tại các vị trí nhận biết của enzyme giới hạn
XhoI/KpnI để tạo được gen crp đột biến mất đoạn so với gen crp ban đầu của
S.choleraesuis, biến nạp vào chủng E.coli JM109.
Hình 3.2: Điện di kiểm tra tách chiết vector pBSIIK+ (A), sản phẩm cắt ADN
plasmid của 4 dòng vector tái tổ hợp pBSIIK+/Pr12 với BamHI/XbaI (B) và 3
dòng pBSIIK(+)/Δcrp (C) với XhoI/KpnI.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt của DNA plasmid của 3 dòng được sàng lọc được bằng enzyme XhoI/KpnI (hình 3.2C) cho thấy DNA plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/Pr12/Pr34 hay pBSIIK+/Δcrp đã được tạo thành công.
3.2. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pRE112/Δcrp
Đoạn gen Δcrp trong plasmid tái tổ hợp pBSIISK+/Δcrp được khuếch đại lên
bằng phản ứng PCR với enzyme PWO polymerase và cặp mồi Pr1F và Pr4R.
Hình 3.3: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân lên từ khuôn là plasmid tái tổ
hợp pBSIISK+/Pr12-1/Pr34-1 bằng cặp mồi Pr1F-Pr4R trên gel agarose 1,2%.
M Pr12 Pr34 Δcrp B pBSIIK+ 1 2 3 A C
Đoạn gen crp được khuếch đại có kích thước khoảng 3000bp đạt nồng độ 600 µg/ml. Đoạn gen Δcrp sau khi tinh sạch từ gel agarose, được đem xử lý với enzyme XbaI và KpnI cùng với plasmid pRE112 để tiến hành lai ghép và biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli χ7213 khả biến.
Các thể biến nạp phát triển trên môi trường LB chứa Chloramphenicol 30 µg/ml và DAP 50µg/ml được tách chiết plasmid và cắt kiểm tra sự có mặt của đoạn gen Δcrp bằng enzyme XbaI, KpnI.
Hình 3.4: Điện di kiểm tra sản phẩm cắt của 5 dòng chọn lọc vector tái tổ
hợp pRE112/Δcrp bằng cặp enzyme XbaI và KpnI trên gel agarose 1,2%.
Kết quả thu được cho thấy có 4 dòng xuất hiện 2 band, 1 band có kích thước khoảng 5000 bp tương ứng với plasmid pRE112 và 1 band có kích thước khoảng 3000 bp tương ứng với gen crp. Điều này cho thấy đã tạo thành công dòng plasmid tái tổ hợp pRE112/Δcrp. Các dòng này sẽ được sử dụng để chuyển gen Δcrp vào chủng Salmonella choleraesuis bằng phương pháp tiếp hợp.
3.3. Tạo chủng S. choleraesuis Smith mang gen crp đột biến
3.3.1. Tiếp hợp E.coli χ7213/pRE112/Δcrp với S. choleraesuis
Dòng E.coli χ7213/pRE112/Δcrp-4 được lựa chọn để thực hiện quá trình tiếp hợp chuyển plasmid tái tổ hợp vào S. choleraesuis.
Hai chủng vi khuẩn được tiếp hợp và ủ qua đêm. Các màng lai được tráng rửa với đệm PBS để thu tế bào và cấy trải lên môi trường chọn lọc LB chứa
M pRE112 Δcrp 1 2 3 4
M Pr12
Chloramphenicol (Cm) để chỉ cho phép những tế bào S. choleraesuis đã tiếp hợp thành công mang plasmid pRE112/Δcrp-4 sinh trưởng và phát triển.
Kết quả trên các đĩa môi trường chọn lọc, chúng tôi thu được khoảng từ 100- 300 khuẩn lạc trên mỗi đĩa, trong khi ở các đĩa đối chứng chỉ cấy riêng từng chủng thì không xuất hiện khuẩn lạc nào. Điều này chứng tỏ, quá trình tiếp hợp giữa
S.choleraesuis và E.coli χ7213/pRE112/Δcrp-4 đã được thực hiện thành công.
Hình 3.5 Các khuẩn lạc S. choleraesuis sau khi tiếp hợp với E.coli
χ7213/pRE112/Δcrp-4 mọc trên môi trường chọn lọc LB + Cm.
3.3.2. Sàng lọc dòng tế bào S. choleraesuis mang gen crp đột biến
Những khuẩn lạc S. choleraesuis mọc trên môi trường LB + Cm được chọn ngẫu nhiên để cấy tinh sạch một lần trên môi trường chọn lọc (LB+Cm). Từng khuẩn lạc riêng rẽ thu được sau quá trình tinh sạch được cấy vào môi trường lỏng LB không muối, không kháng sinh (NB) để quá trình trao đổi chéo diễn ra giữa gen
crp đột biến trong plasmid và gen crp nguyên vẹn trong genome của S. cholerasuis. Dịch nuôi cấy sau 6h, được pha loãng đến 10-5 và cấy đồng thời lên 2 loại môi trường: môi trường LB không muối, không kháng sinh (NA) và môi trường NA có chứa 5% đường sucrose để chọn lọc những dòng S. choleraesuis kháng sucrose, tức là những dòng đã diễn ra quá trình trao đổi chéo làm mất đi gen SacB1, một gen
tổng hợp enzyme luvansucrase thuỷ phân đường sucrose tạo sản phẩm luvan là chất gây ức chế sự sinh trưởng hoặc có khả năng gây chết đối với tế bào Salmonella.
Những dòng kháng sucrose này được tiếp tục cấy đồng thời lên 2 loại môi
trường: môi trường LB và môi trường LB có chứa Cm để loại bỏ những dòng kháng
sucrose do gen SacB1 bị đột biến.
Cuối cùng tiến hành kiểm tra các dòng chọn lọc được bằng phản ứng PCR với 2 cặp mồi Pr5F-Pr6R, và Pr6F-Pr7R.
Hình 3.6 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ genome của S. choleraesuis
539/Δcrp (1), S. choleraesuis Smith (2), plasmid của χ7213/pRE112/Δcrp (3) với
cặp mồi Pr5F-Pr6R (ảnh trái), và Pr6R-Pr7F (ảnh phải) trên gel agarose 1,2%.
Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi Pr5F-Pr6R cho thấy đoạn gen
Δcrp được khuếch đại có kích thước khoảng 600 bp, tương ứng với đoạn gen Δcrp
trong plasmid χ7213/pRE112/Δcrp. Điều này chứng tỏ đoạn gen crp đã được gây đột biến ở dòng S.choleraesuis 539.
Theo hình 3.13, hình phải cho thấy gen crp của dòng S.choleraesuis 539 (kích thước 1400 bp) bị mất đi một đoạn gen khoảng 300 bp so với chủng S. choleraesuis
Smith (có kích thước 1700bp). Điều này chứng tỏ đã gây đột biến thành công gen
crpở dòng S.choleraesuis 539. M 1 2 3 1500bp 500bp M 1 2 1500b p
3.4. Kết quả giám định đặc tính sinh hóa của chủng S. choleraesuis nhược độc
mang gen crp đã bị đột biến
3.4.1. Tốc độ sinh trưởng
Tốc độ sinh trưởng của S. chorelasuis 539/Δcrp được chúng tôi xác định trên cả môi trường LB agar, LB dịch, và tiến hành so sánh với S. chorelasuis Smith.
Trên môi trường LB agar, sau 24h nuôi cấy ở 37oC, khuẩn lạc S. chorelasuis
539/Δcrp nhỏ hơn rõ rệt so với S. chorelasuis Smith.
Hình 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc của S.chorelasuis Smith và S. chorelasuis
539/Δcrp sau 24h nuôi cấy.
Trong môi trường dịch thể, chúng tôi tiến hành theo dõi tốc độ sinh trưởng của S. chorelasuis 539/Δcrp và S. chorelasuis Smith trong 10h thông qua mật độ vi sinh vật tại bước sóng 600 nm. Kết quả thu được cho thấy, S. chorelasuis mang gen
crp đột biến sinh trưởng chậm hơn nhiều so với thể dại. Sau 8h, trong khi
S.chorelasuis Smith đã đạt đến pha cân bằng, thì S. chorelasuis vẫn đang tăng sinh chậm tại pha log.
Tốc độ sinh trưởng của S.chorelasuis 539 và S. chorelasuis wild type 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0h 2h 4h 6h 8h 10h Thời gian O D ( 6 0 0 n m ) S. cholerasuis (WD) S. cholerasuis 539 (Δcrp)
Hình 3.8 Biểu đồ tốc độ sinh trưởng của các chủng S. choleraesuis Δcrp và S.
choleraesuis Smith trong 10 giờ nuôi cấy
3.4.2. Đặc tính sinh hóa
Tiến hành lên men S. chorelasuis 539/Δcrp trong môi trường dinh dưỡng lỏng có bổ sung 10% đường, cùng chất chỉ thị pH phenol red cho phép phát hiện sự lên men đường diễn ra làm giảm pH của môi trường. S. chorelasuis được tiến hành lên men đồng thời để so sánh.
Sau 24h nuôi cấy lắc tại 37oC, kết quả cho thấy S. chorelasuis 539/Δcrp đã mất khả năng lên men đối với hầu hết các đường, trừ glucose. Kết quả này phù hợp với những nhận định và tham khảo trước đây, vì vậy, gen crp được tin tưởng đã được đột biến thành công ở S. chorelasuis.
Hình 3.9 Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng S. choleraesuis Smith
Bảng 3.1: Các đặc tính sinh hóa của chủng S. choleraesuis Smith và S.choleraesuis/Δcrp
Kết quả giám định
TT Đặc tính sinh vật hoá học
S. choleraesuis Smith S. choleraesuis /Δcrp
1 Glucose + + 2 Maltose + - 3 Sucrose - - 4 Lactose - - 5 Xylose + - 6 Raffinose + - 7 Mannitol + - 8 Rhamnose + - 3.4.3. Tính ổn định của chủng đột biến
Các chủng S. choleraesuis/Δcrp được cấy chuyển qua 20 đời. Tiến hành tách chiết genome qua các chủng đời thứ 5, 10, 15, 20 để kiểm tra tính ổn định của các chủng.
Kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi Pr5F-Pr6R, Pr7F-Pr6R đối với chủng S. choleraesuis/Δcrp.
Hình 3.10 Sản phẩm PCR từ genome của S. cholerasuis 539/Δcrp với cặp
mồi Pr5F-Pr6R, Pr6R-Pr7F ở các đời 1, 5, 10, 15, 20. M 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 Ghi chú: M: marker 1 : S. choleraesuis/Δcrp đời thứ 1 2: S. choleraesuis/Δcrp đời thứ 5 3 : S. choleraesuis/Δcrp đời thứ 10 4 : S. choleraesuis/Δcrp đời thứ 15 5 : S. choleraesuis/Δcrp đời thứ 20
Theo hình 3.10 ta thấy đoạn gen crp đột biến ổn định trong bộ gen của S. choleraesuis sau 20 đời cấy truyền (100%). Như vậy, tính ổn định gen đột biến trong bộ gen của chủng S. choleraesuis là rất cao.
3.4.4. Giám định kháng nguyên H, O
S. choleraesuis có công thức kháng nguyên S. 67: c-1,5 [4]. Kết quả giám định kháng nguyên cho thấy S. choleraesuis 539 tạo phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh nguyên O67, và H1,5 trùng hợp S.choleraesuis. Như vậy đột biến gen crp đã không làm thay đổi sự biểu hiện hai kháng nguyên này của S.choleraesuis.
3.4.5. So sánh trình tự gen của S. choleraesuis Smith và S. choleraesuis/Δcrp
Để khẳng định chắc chắn hơn kết quả gây đột biến gen crp, đoạn gen Δcrp
được khuếch đại bằng cặp mồi Pr5F-Pr6R, sau đó tinh sạch sản phẩm thu được và gửi giải trình tự tại công ty Macrogen, Hàn Quốc. Trình tự thu được được tiến hành xử lý, so sánh với trình tự gen crp (SC-B67) của S. choleraesuis trên ngân hàng Genbank, từ đó chúng tôi xác định được gen Δcrp bị mất đi một đoạn 322bp, từ nucleotide 545 đến nucleotide 867, so với gen crp ban đầu.
Khi so sánh kết quả giải trình tự gen của S. choleraesuis Smith và S. choleraesuis/Δcrp, ta thấy đoạn gen crpở chủng đột biến bị mất 1 đoạn khoảng 322 nucleotide từ nucleotide thứ 545 đến nucleotide thứ 867. Như vậy, đoạn gen crp đã được gây đột biến thành công trên bộ gen của S. choleraesuis.
S. choleraesuis Smith 541 AATGGTTCTTGTCTCATTGCCACATTCATAAGTACCCGTCAAAGAGCACGCTGATTCACC 600 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
S. choleraesuis /Δcrp 3570121 AATGGTTCTTGTCTCATTGCCACATTCATAAGTACCCGTCAAAGAGCACGCTGATTCACC 3570180
S. choleraesuis Smith 601 AGGGTGAAAAAGCAGAAACGCTGTACTACATCGTTAAAGGCTCCGTGGCAGTGCTGATCA 660 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
S. choleraesuis /Δcrp 3570181 AGGGTGAAAAAGCAGAAACGCTGTACTACATCGTTAAAGGCTCCGTGGCAGTGCTGATCA 3570240
S. choleraesuis Smith 661 AAGATGAAGAAGGGAAAGAAATGATCCTTTCTTATCTGAATCAAGGTGATTTTATTGGTG 720 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
S. choleraesuis /Δcrp 3570241 AAGATGAAGAAGGGAAAGAAATGATCCTTTCTTATCTGAATCAAGGTGATTTTATTGGTG 3570300
S. choleraesuis Smith 721 AACTGGGCCTGTTTGAAGAAGGCCAGGAACGCAGCGCCTGGGTACGTGCGAAAACCGCAT 780 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
S. choleraesuis /Δcrp 3570301 AACTGGGCCTGTTTGAAGAAGGCCAGGAACGCAGCGCCTGGGTACGTGCGAAAACCGCAT 3570360
S. choleraesuis Smith 781 GTGAGGTCGCTGAAATTTCCTACAAAAAATTTCGCCAATTAATCCAGGTCAACCCGGATA 840 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
S. choleraesuis /Δcrp 3570361 GTGAGGTCGCTGAAATTTCCTACAAAAAATTTCGCCAATTAATCCAGGTCAACCCGGATA 3570420
S. choleraesuis Smith 841 TTCTGATGCGCCTCTCTTCCCAGATGGCTCGTCGCTTACAAGTCACCTCTGAAAAAGTAG 900 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
S. choleraesuis /Δcrp 3570421 TTCTGATGCGCCTCTCTTCCCAGATGGCTCGTCGCTTACAAGTCACCTCTGAAAAAGTAG 3570480
S. choleraesuis Smith 901 GTAACCTCGCCTTCCTTGACGTCACCGGGCGTATCGCTCAGACGCTGCTGAATCTGGCGA 960 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
S. choleraesuis /Δcrp 3570481 GTAACCTCGCCTTCCTTGACGTCACCGGGCGTATCGCTCAGACGCTGCTGAATCTGGCGA 3570540
Hình 3.11 Trình tự đoạn gen khuếch đại từ cặp mồi Pr5F- Pr6R của gen Δcrp
với đoạn 322 bp (545-867) (bôi đen) bị mất so với gen crp của Salmonella choleraesuis nhược độc.
Kết luận và kiến nghị
Kết luận
Thông qua những kết quả nghiên cứu của đề tài, chúng tôi đi đến những kết luận:
1. Đã tạo được dòng vector pBSIIK+/crp. 2. Đã tạo được dòng plasmid pRE112/crp.
3. Đã tạo thành công chủng S. choleraesuis 539 mang gen crp đột biến.
4. Xác định được các đặc tính nuôi cấy, sinh hóa của chủng S. choleraesuis 539 mang gen crp đột biến.
Kiến nghị
1. Tiếp tục gây đột biến gen asd trên chủng S. choleraesuis 539 để tạo chủng
S.choleraesuis mang hai gen crp và asd đột biến.
2. Từ chủng nói trên nghiên cứu quy trình sản xuất vắc-xin tái tổ hợp phòng hai bệnh phù đầu và phó thương hàn lợn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak, Cheryl L. Patten, Công nghệ sinh học phân tử - Nguyên lý và ứng dụng của ADN tái tổ hợp, Nxb KHKT.
2. Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng (1986), Bệnh gia súc non tập II, NXB
NN, Hà Nội.
3. Hoàng Trọng Phán, giáo trình “Di truyền học”, Đại học Huế.
4. Nguyễn Như Thanh (2001), Vi sinh vật thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
5. Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (1997), Vi sinh
vật thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
6. Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú, Nguyễn Thị Sở, Trần Thị Thu Hà (1989), Kết quả điều tra về tình hình nhiễm vi khuẩn đường ruột tại một số cơ sở chăn nuôi lợn, tuyển tập Kết quả nghiên cứu khoa học và kỹ thuật thú y 1985-1989, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 1989.
7. PGS.TS. Nguyễn Như Thanh, (2001), Vi sinh vật thú y, NXB Nông Nghiệp Hà Nội.
8. Phùng Quốc Chướng (1995), Tình hình nhiễm Salmonella ở lợn vùng Tây Nguyên và khả năng phòng trị, Luận án PTS KH Nông Nghiệp, Hà Nội. 9. Vũ Bình Minh, Cù Hữu Phú (1999), Kết quả phân lập vi khuẩn E.coli và
Salmonella ở lơn mắc bệnh tiêu chảy, xác định một số đặc tính sinh vật hóa học của các chủng vi khuẩn phân lập được, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, tập 6– Hội thú y Việt Nam, Hà Nội
TIẾNG ANH
10.Chen Z.W., Hsuan S.L., Liao J.W., Chen T.H., Wu C.M., Lee W.C., Lin C.C., Liao C.M., Yeh K.S., Winton J.R., Huang C, Chien M.S., (2010), Mutations in the Salmonella enterica serovar Choleraesuis cAMP-receptor protein gene lead to functional defects in the SPI-1 Type III secretion system, Vet Res, (41), 1-5.
11.Chu C.Y., Wang S.Y., Chen Z.W., Chien M.S., Huang J.P., Chen J.J., et al., (2007), Heterologous protection in pigs induced by a plasmid-cured and crp
gene-deleted S.choleraesuis live vaccine, Vaccine, (25), 7031–7040.
12.Chuan Y.U. et al., (2010), Construction and Characterization of a
S.choleraesuis C78-1 crp Deletion Mutant, Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 41 (5).
13.Dean A..G., Ching Y.C., Williams and Harden L.B. (1972), “Test for E.coli Enterotoxin using infant mice”, J. Infect, Dis, 125(4): 407-11.
14.Gao H., Zhang Y., Yang L., Liu X., Guo Z., Tan Y., Han Y., Huang X., Zhou D., Yang R.,.(2011), Regulatory effects of cAMP receptor protein (CRP) on porin genes and its own gene in Yersinia pestis, Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing 100071, PR China.
15.Hackett J., (1990), Salmonella-based vaccines, Vaccine, 8(1): 5-11.
16.Kang H.Y., Dozois C.M., Tinge S.A., Lee T.H., Curtiss R., (2002), Trasduction-mediated transfer of unmarked delection and point mutations through use of counterselectable suicide vector, 184(1): 307-12..
17.Kennedy M.J., Yancey R.J. Jr, Sanchez M.S., Rzepkowski R.A., Kelly S.M., Curtiss R. III, (1999), Attenuation and immunogenicity of cya crp
18.Moos M.., (1995), Models of risk assessments for biologicals or related products in the European Union, Revue Scientifique et
19.Morris I.A, Way C., Sojka W.J. (1976), “The effect of T and B lymphocyte depletion on the protection of mice vaccinated with a gel Emutant of Salmone.la typhimurium”, Bristh J. of Exp.
20.Salmon, D. E. And Smith. 1885. Report on swine plague. U.S. Bureau of Animal Industies, 2nd Annual Report, U.S. Government Printing Office, Washington, DC.
21.Sandefur P.D., Peterson J.W. (1977), Neutralization of Salmonella Toxin- induced elongation of chinese- hamster-ovary cell choleranti Toxin, Ibid,Vol 1.
22.Schwartz K.J., Salmonellosis, Straw B.E., D’Allaire S., Mengeling W., Taylor D.J. (Eds.), (1999), Disease of swine, Iowa State University Press, Ames.
23.Sedlock D.M., Deibel R.H. (1978), Dectection of Salmonella typhimurium
EnteroToxin using rabbit iieal loops, Can.J.Microbiol.
24.Sedlock D.M., Koupal B.N., Deibel R.H. (1978), Production and partial