M Ở ĐẦU
2.3.10 Kiểm tra các đặc tính sinh hóa
2.3.10.1 Xác định tốc độ sinh trưởng của S. chorelasuis 539/Δcrp
Nguyên vật liệu:
-Môi trường LB agar. -Môi trường LB dịch.
Tiến hành:
-Nuôi S. chorelasuis 539/Δcrp và S. chorelasuis thể dại trên môi trường LB agar qua đêm ở 37oC.
-Cấy chuyển sang môi trường dịch thể.
-Quan sát và so sánh tốc độ sinh trưởng trong 10h thông qua mật độ vi sinh vật tại bước sóng 600nm.
2.3.10.2 Khả năng lên men đường của S. chorelasuis 539/Δcrp
Nguyên vật liệu:
-Môi trường dinh dưỡng.
-Đường: glucose, saccharose, lactose, rhanose, manitol, maltose, arabinose, xylose.
-Chất chỉ thị pH phenol red.
Tiến hành:
-Lên men S. chorelasuis 539/Δcrp và chủng S. chorelasuis ban đầu trong môi trường dinh dưỡng lỏng có bổ sung 10% đường, cùng chất chỉ thị pH phenol red, lắc 24h ở 37oC.
-So sánh khả năng lên men đường của chủng đột biến và chủng gốc.
2.3.10.3 Phương pháp ngưng kết kháng huyết thanh O và H
Nguyên vật liệu:
- NaCl 0.85%
- Kháng huyết thanh O, H
Tế bào S. choleraesuis mang gen đột biến sau khi hấp ở 1210C, ly tâm thu tế bào và hoàn nguyên trong NaCl 0.85%. Dịch thu được đem nhỏ lên phiến kính chứa 20µl kháng huyết thanh O, hoặc H.
2.3.10.4 Kiểm tra tính ổn định của gen đột biến
Nguyên vật liệu:
- LB Broth
- Thành phần phản ứng PCR (Bảng 2.5)
Tiến hành:
Chủng S. choleraesuis mang gen đột biến được cấy chuyển liên tiếp trong môi trường LB dịch qua 20 đời. Tách chiết genome ở đời 1, 5, 10, 15, 20 sau đó kiểm tra
bằng phản ứng PCR. 2.3.10.5 So sánh trình tự gen Nguyên vật liệu: - Cặp mồi Pr5F-Pr6R - Thành phần phản ứng PCR (Bảng 2.5) Tiến hành:
Tiến hành khuếch đại đoạn gen Δcrp bằng cặp mồi Pr5F-Pr6R, sau đó tinh sạch sản phẩm, gửi giải trình tự tại công ty Macrogen, Hàn Quốc.
Tìm kiếm trình tự gen crp của S. choleraesuis trên ngân hàng Genbank. So sánh kết quả giải trình tự của S. choleraesuis Smith và S. chorelasuis
2.4 SƠ ĐỒ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
Tách chiết genome của S.choleraesuis Smith
Nhân đoạn gen Pr12 bằng PCR
Xử lý RE với
pBSIISK(+) Xử lý RE với Pr12
Lai ghép sử dụng T4 ligase
Biến nạp vào E.coli JM109
Kiểm tra kết quả tạo dòng bằng RE
Tách chiết plasmid Nhân đoạn gen Pr34 bằng PCR
Xử lý với RE Xử lý với RE
Lai ghép sử dụng T4 ligase
Biến nạp vào E.coli JM109 Kiểm tra kết quả tạo dòng bằng RE
Tách chiết plasmid
Xử lý với RE Xử lý pRE112 với RE
Lai ghép sử dụng T4 ligase
Biến nạp vào E.coli χ7213
Kiểm tra kết quả tạo dòng bằng RE
Tiếp hợp χ7213/pRE112/Δcrp với
S.choleraesuis Smith Giám định các đặc tính sinh vật, hóa học
của các chủng S.choleraesuis Δcrp
Chương 3. Kết quả và thảo luận