Cellulase th y phân cellulose t nhiên và các d n xu t nh carboxymethyl
cellulose (CMC) ho c hydroxyethyl cellulose (HEC). Cellulase c t liên k t -1,4-glucoside trong cellulose, lichenin và các -D-glucan c a ng c c.
b n nhi t và tính đ c hi u c ch t có th khác nhau. Cellulase ho t đ ng pH t 3-7, nh ng pH t i thích trong kho ng 4-5. Nhi t đ t i u t 40-50 đ C. Ho t tính
cellulase b phá h y hoàn toàn 80 đ C trong 10 đ n 15 phút. b c ch b i các s n ph m ph n ng c a nó nh glucose, cellobiose và b c ch hoàn toàn b i Hg. Ngoài ra, cellulose còn b c ch b i các ion kim lo i khác nh Mn, Ag, Zn nh ng m c đ
nh .
Tr ng l ng c a enzyme cellulase thay đ i t 30 -110 KDa Ngu n g c c a enzyme cellulase
• c thu nh n t các ngu n khác nhau:
– ng v t: d ch ti t d dày bò, các nhóm thân m m…
– Th c v t: trong h t ng c c n y m m nh đ i m ch, y n m ch, lúa mì m ch đen…
– Vi sinh v t: các lo i x khu n, vi khu n, n m s i, n m men…
• Trong th c t ng i ta th ng thu nh n enzyme cellulase t vi sinh v t. Các ch ng vi sinh v t th ng s d ng:
– N m m c: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus candidus… – X khu n: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli…
– Vi khu n: Acetobacter xylinum, Bacillus subtilis, Bacillus pumilis. 1.4.3 Phân lo i enzyme cellulase
V ph ng di n hóa h c, cellulose là m t polyme đ c c u t o t các đ n v - glucose n i v i nhau b ng liên k t -1,4-glucoside. Cellulose là thành ph n polysaccharide ch y u c a vách t bào th c v t.
D a vào đ c đi m c a c ch t và c ch phân c t, enzyme cellulase đ c chia thành ba lo i:
- 1,4- -D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)
- 1,4- -D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4)
- -D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21)
và trong m t s n m nh Trichoderma, Aspergillus,... 1.4.4 C ch tác d ng c a enzyme cellulase
1.4.4.1C ch 1,4- -D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)
Enzyme này còn có tên g i khác nh : exoglucanase, exo- -1,4-glucanase,
cellobiohydrolase, exo – cellobiohydrolase, exo- -1,4-glucan cellobiohydrolase, 1,4- -D-glucan cellobiosidase, cellobiosidase, CBH 1, C1 cellulase, avicelase. Enzyme này th y phân liên k t 1,4- -D-glucoside t đ u không kh c a chu i cellulose đ t o thành celllobiose.
Hình 1.13. C ch ho t đ ng c a exoglucanase 1.4.4.2C ch 1,4- -D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4)
Enzyme này còn có tên g i khác nh : endoglucanase, endo-1,4- -D-glucanase, endo-1,4glucanase, -1,4-endoglucanhydrolase, carboxymethyl cellulase,
celludextrinase, cellulase A, cellulosin AP, alkali cellulase, cellulase A3, 9,5 cellulase, Avicelase, pancellase SS.
Enzyme này th y phân ng u nhiên liên k t 1,4- -D-glucoside gi a m ch c a chu i cellulose, lichenin và các -D-glucan c a ng c c.
1.4.4.3C ch -D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) Enzyme này có tên g i khác nh là: Enzyme này có tên g i khác nh là:
-glucosidase, -D-glucosidase, -1,6-glucosidase, -glucoside glucohydrolase, p- nitrophenyl -glucosidase, aryl- -glucosidase, gentiobiase, cellobiase, emulsin, elaterase, arbutinase, amygdalinase, primeverosidase, amygdalase, limarase, salicilinase.
Enzyme này th y phân g c -D-glucoside không kh đ u t n cùng đ phóng thích ra -D-glucose.
Hình 1.15 S phân h y c a -glucosidase
Hình 1.16 S phân h y c a -D-glucoside glucohydrolase
1.4.4.4 Ho t l c c a enzyme cellulase (c ch th y phân cellulose)
Th y phân cellulose ph i có s tham gia c a c ba lo i enzyme cellulase nh endoglucanase, exoglucanase và -glucosidase. Thi u m t trong ba lo i enzyme trên thì không th th y phân phân t cellulose đ n cùng.
T nh ng nghiên c u riêng l đ i v i t ng lo i enzyme đ n nghiên c u tác đ ng t ng h p c a c ba lo i enzyme cellulase, nhi u nhà khoa h c đ u đ a ra k t lu n chung là các lo i enzyme cellulase s thay phiên nhau phân h y cellulose đ t o thành s n ph m cu i cùng là glucose. Có nhi u cách gi i thích khác nhau v c ch tác đ ng c a cellulase, trong đó cách gi i thích do Erikson đ a ra đ c nhi u ng i công nh n
Theo Erikson và c ng tác viên (1980), c ch tác đ ng hi p đ ng c a 3 lo i
cellulose nh sau: đ u tiên endoglucanase tác đ ng vào vùng vô đnh hình trên b m t cellulose, c t liên k t -1,4-glucoside và t o ra các đ u m ch t do. Ti p đó
exoglucanase t n công c t ra t ng đo n cellobiose t đ u m ch đ c t o thành. K t qu tác đ ng c a endoglucanase và exoglucanase t o ra các celloligosaccharid m ch ng n, cellobiose, glucose. -glucosidase th y phân ti p và t o thành glucose.
Các loài vi sinh v t có kh n ng sinh t ng h p cellulase trong đi u ki n t nhiên
th ng b nh h ng b i tác đ ng nhi u m t c a các y u t ngo i c nh nên có loài phát tri n r t m nh, có loài l i phát tri n y u. Chính vì th , vi c phân h y cellulose trong t nhiên đ c ti n hành không đ ng b , x y ra r t ch m.
Trong đi u ki n phòng thí nghi m hay đi u ki n công nghi p, vi c phân h y cellulose b ng enzyme, ngoài các y u t k thu t nh nhi t đ m pH, n ng đ c ch t,
l ng enzyme…, m t y u t h t s c quan tr ng là tính đ ng b c a h enzyme cellulase t nhi u ngu n vi sinh v t khác nhau. Quá trình th y phân cellulose ch có th đ c ti n hành đ n s n ph m cu i cùng khi s d ng đ ng b ba lo i enzyme cellulase.
M i lo i vi sinh v t ch có kh n ng sinh t ng h p u vi t m t lo i enzyme. Chính vì th c n ph i khai thác enzyme cellulase t nhi u ngu n vi sinh v t.
1.2.1 Ph gia gi màu CuCl2 [7]
ng (II) clorua, CuCl2. B t màu nâu, háo n c; d ng dung d ch có màu xanh kh i l ng riêng 3,054 g/cm3; nhi t đ nóng ch y = 6300C; 9930C, b phân hu sinh
ra clo. Hiđrat CuCl2. 2H2O là các tinh th l ng tr , màu l c; lên hoa khi đ trong không khí; kh i l ng riêng 2,38 g/cm3; d tan trong n c. Dùng làm ch t xúc tác cho m t s ph n ng hoá h c, ch t c m màu, m c, ch t b o qu n g .
Tính đ c c a đ ng vƠ l ng cho phép s d ng
Trong t p chí phát tri n KH&CN, t p 10, s 01-2007, k t qu nghiên c u nhi u công trình cho th y:
- i v i cây tr ng: Theo k t qu nghiên c u nhi u công trình cho th y Cu có vai trò r t quan tr ng đ i v i s phát tri n c a cây tr ng. Cây tr ng thi u Cu th ng có t
l quang h p b t th ng, đi u này cho th y Cu có liên quan đ n m c ph n ng oxit hoá c a cây. Lý do chính c a đi u này là trong cây thi u ch t Cu thì quá trình oxit hoá Acid Ascorbic b ch m, Cu hình thành m t s l n ch t h u c t ng h p v i protein, Acid amin và m t s ch t khác mà chúng ta th ng g p trong n c trái cây.
- Ngoài nh ng nh h ng do thi u Cu, thì vi c th a Cu c ng x y ra nh ng bi u hi n ng đ c mà chúng có th d n t i tình tr ng cây ch t. Lý do c a vi c này là do dùng thu c di t n m, thu c tr sâu, đã khi n cho ch t li u Cu b c n l i trong đ t t n m này qua n m khác, ngay c bón phân Sulfat Cu c ng gây tác h i t ng t .
- i v i con ng i: Nguyên li u d n đ n ng đ c Cu c a con ng i có th là do: u ng n c thông qua h th ng ng d n n c b ng Cu, n th c ph m có ch a l ng Cu
cao nh Chocolate, nho, n m, tôm…, b i trong các h b i có s d ng thu c di t t o (Algaecides) có ch a Cu đ làm v sinh h , u ng bia hay r u đ mà c hai đ c l c v i Cu sulfides. ây là m t ch t đ c đ i v i đ ng v t: i v i ng i 1g/1kg th tr ng
đã gây t vong, t 60 -100mg/1kg gây bu n nôn. Theo t p chí phát tri n khoa h c và công ngh ( 2007), Cu nh h ng nghiêm tr ng đ n s c kho do s thi u h t c ng nh d th a. Cu thi t y u cho vi c s d ng s t (Fe), b nh thi u máu do thi u h t Fe tr
CH NG II: V T LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U
2.1 a đi m-v t li u-thi t b
2.1.1 a đi m và th i gian ti n hành thí nghi m
- Mua lá trà xanh t i ch Th D u M t- Bình D ng
- Th c hi n nghiên c u t i phòng thí nghi m sinh hoá tr ng đ i h c M TP.HCM
- Th i gian ti n hành : t 11/2013 đ n 4/2014 2.1.2 V t li u
- Nguyên li u: lá trà xanh có ngu n g c t Bình D ng đ c thu mua ch Th D u M t. Lá trà s d ng cho thí nghi m không non c ng không quá già
-
Hình 2.1 Lá trà
- N c: ngu n n c s ch t phòng thí nghi m sinh hoá
- Enzyme cellulase: phân l p t Aspergillus niger xu t x t c - Hoá ch t:
+ Ph gia gi màu: CuCl2 xu t x Trung Qu c
+ Dung d ch Folin: xu t x t c
+ Than ho t tính: xu t x Trung Qu c
+ Na2CO3:xu t x Vi t Nam
+ Các ch t hoá ch t ph c v phân tích các ch tiêu khác
2.1.3 Thi t b : Máy xay, th t, dao, máy cô đ c, t s y, n i , b p đi n, màng l c, máy
đo OD 2.2 Ph ng pháp nghiên c u: 2.2.1 Quy trình s n xu t d ki n S đ C t nh Ch n Xay Trích ly S y L c Thành ph m N c Bã trà Ph gia gi màu Cu2+ Lá trà xanh X lý cellulase óng gói
2.2.2 Thuy t minh quy trình
Ch n
- M c đích: gi cho lá trà có màu t i xanh nh nhi t đ cao tiêu di t các enzyme polyphenol oxidases gây nên ph n ng oxy hóa làm bi n đ i màu lá trà
- Cách ti n hành: Lá trà xanh sau khi đ c l a ch n đ c ch n nhi t đ kho ng 80-1000C, trong kho ng th i gian 1-5 phút đ b t ho t các enzyme trong lá trà vì các enzyme polyphenoloxydase th ng không ho t đ ng nhi t 600C tr lên, do đó quá trình oxy hóa không di n ra làm nh h ng đ n màu s c lá trà. Khi ch n b sung thêm Cu2+đ gi cho màu lá trà đ c t i xanh, vì Cu2+gi cho c u trúc clorophyl đ c b n v ng. Sau khi ch n các lá đ c r a l i v i n c l nh.
C t
- M c đích: lá trà đ c c t nh đ c u trúc lá nh h n thu n ti n cho công đo n xay ti p theo.
- Cách ti n hành: dùng dao c t nh ng lá trà thành nh ng ph n nh h n v i kích c kho ng 2cm
Xay
- M c đích: sau khi lá trà đ c c t nh , s đ c xay khô đ các t bào lá trà b phá v c u trúc m t ph n, đ quá trình x lý enzyme, trích ly đ c d dàng thu đ c hi u su t cao
- Cách ti n hành: cho lá trà đã c t nh vào máy xay sinh t và xay đ n khi lá trà tr nên nhuy n.
X lý cellulase
- M c đích: vì lá trà có thành t bào c u t o t cellulose r t c ng ch c do đó n u ch trích ly b ng n c nhi t đ 800C thì các ch t trong trà không th ra ngoài do s c n tr c a thành cellulose. Vì v y công đo n này dung enzyme cellulase đ c t cellulose thành nh ng m ch ng n đ các ch t đ c đi ra ngoài d dàng h n t đó
hi u su t thu h i s cao h n.
Cách ti n hành: khi trà đã đ c xay nhuy n, sau đó b sung n c theo t l 10g lá trà v i 50ml n c sau đó enzyme đ c cho vào v i n ng đ thích h p cùng v i nhi t đ và th i gian t i u đ enzyme ho t đông t t nh t trong quá trình x lý enzyme.
Trích ly
- M c đích: tách các ch t trong lá trà vào n c
- Cách ti n hành: trà sau khi x lý enzyme đ c trích ly 800C trong vòng 10 phút
L c
- M c đích: công đo n này nh m thu d ch ch a các ch t tan và lo i b bã trà là nh ng ch t khô không hòa tan
- Cách ti n hành: dùng kh n s a cho toàn b trà vào và v t ki t toàn b d ch, ta
thu đ c d ch trà ph n còn l i là bã trà S y
- M c đích:thu đ c s n ph m d ng b t
- Cách ti n hành: sau khi thu đ c d ch trà, toàn b d ch đem đi s y khô nhi t
đ th p kho ng 550C đ n 650C trong vòng 24gi đ không nh h ng đ n ch t l ng và màu s c b t trà thành ph m, dch đ c s y cho đ n khi đ m đ t kho ng 3-5%.
óng gói
- M c đích: b o qu n s n ph m
- Cách ti n hành: dùng bao nh a PE đ ng s n ph m b t trà sau đó hút chân không và đóng kín bao bì b ng m t thi t b hút chân không và dán kín bao bì
2.2.3 S đ thí nghi m:
Hình 2.3: S đ thí nghi m
Kh o sát n ng đ cellulase trong quá trình x lý enzyme đ n hi u su t trích ly
Kh o sát nguyên li u
Kh o sát nh h ng c a nhi t đ và th i gian ch n đ n màu s c lá trà
Kh o sát nh h ng c a hàm l ng CuCl2đ n màu s c lá trà khi ch n
Kh o sát nh h ng c a nhi t đ trong quá trình x lý enzyme đ n hi u su t trích ly và ch t l ng d ch trà
Kh o sát nh h ng c a th i gian trong quá trình x lý enzyme đ n hi u su t trích ly và ch t l ng d ch trà
T i u hóa quá trình x lý enzyme cellulase trên lá trà
Kh o sát nh h ng c a hàm l ng n c đ n hi u su t trích ly trong quá trình trích ly d ch trà
Kh o sát nh h ng c a nhi t đ s y đ n màu s c và đ m b o qu n b t trà xanh
2.2.4 Các thí nghi m 2.2.4.1 Kh o sát nguyên li u lá trà 2.2.4.1 Kh o sát nguyên li u lá trà Các y u t kh o sát trong nguyên li u - Ch t khô - Tanin, polyphenol t ng - Tro Cách ti n hành: - Kh o sát đ m b ng ph ng pháp s y đ n kh i l ng không đ i (ph l c 1) - Kh o sát ch t khô b ng ph ng pháp s y (ph l c 1) - Kh o sát tanin b ng ph ng pháp Leventhal (ph l c 1)
2.2.4.2 Thí nghi m1: Kh o sát nh h ng c a nhi t đ và th i gian ch n đ n màu s c lá trà
- M c tiêu: tìm ra th i gian và nhi t đ ch n thích h p nh t đ màu c a lá trà
đ c gi t t nh t và không nh h ng nhi u đ n màu s c c a s n ph m.
- B trí thí nghi m: ki u hoàn toàn ng u nhiên 2 y u t , có 12 nghi m th c
+ Y u t 1: nhi t đ (A): 700C, 80 0C,900C,1000C + Y u t 2: th i gian (B): 1 phút , 3 phút , 5 phút B ng 2.1: B trí thí nghi m 1 Nhi t đ (A) Th i gian (B)
700C (A1) 80 0C (A2) 900C (A3) 1000C (A4)
1 phút (B1) A1B1 A2 B1 A3 B1 A4 B1