Phương pháp sắc kí lớp mỏng được sử dụng rộng rãi để xác định hàm lượng aflatoxin lần đầu tiên vào những năm 1960. Người ta sử dụng các bản mỏng được tráng bởi silicagel, để xác định aflatoxin.
Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là chloroforin: methnol và choloroform : aceton. Việc thêm nước vào hệ thống dung môi sẽ làm tăng khả năng hòa tan aflatoxin.
Hệ dung môi gồm nước: aceton : chloroform( 1:5;12:88) được đánh giá có khả năng hòa tan aflatoxin tốt nhất. Các bản mỏng đã được chảy qua các dung môi chạy được đưa vào bởi đèn tử ngoại (UV) 365 nm.
Các vết mẫu phân tích tạo màu huỳnh quang xanh da trời hay xanh lá cây. Và có độ dài Rf được so sánh với các vết mẫu phân tích chuẩn. Phương pháp này có thể được xác định lượng từ 3-4.10-4micromet(0.3-0.4mg).
Nhược điểm của phương pháp là phụ thuộc vào người phân tích. Khi so sánh giữa mẫu và các vết của độc tố chuẩn có thể có sự sai lệch kết quả từ 20-30%
SVTH: Nguyễn Văn Phước 42 Lớp 07CSH 3.2.5. Phương pháp sắc kí lỏng cao áp (High ferformane liquid
chromatorgaphy-HPLC)
HPLC là một sắc ký cột (column chromatograph ) đi kèm với một detector nhạy để có thể phát hiện được các chất tách ra trong quá trình chạy sắc ký. Với những tiến bộ kỹ thuật về cột, detector đã chuyển sắc ký cột thành phương pháp phân tích có tốc độ nhanh và hiệu suất cao.
Loại này cần phải có hệ thống bơm cao áp để đẩy pha động với áp suất cao đến khoảng 30Mpa (300 atm) nhằm tạo dòng chảy với lưu lương vài ml/ phút. Số lượng mẩu phân tích bằng HPLC chỉ cần khoảng 20microlit. Phương pháp HPLC sử dụng cả hai pha: Pha bình thường và pha phản.
Hệ thống này dựa trên sự hấp thụ tia tím (uv) và xác định cường độ huỳnh quang. Mẫu phân tích được tác bằng chloroform: nước. Ly tâm chất tác dụng làm sạch qua silicagel pha bình thường sử dụng cột nhối silicagel 0.5m và pha động sử dụng bezen: acetonitrit: acid formic. Giới hạn xác định là 0.5 micromet/kg.
Hình 3.5: Phương pháp sắc kí lỏng cao áp
3.2.6. Phương pháp sắc ký miễn dịch dòng chảy bên (Lateral Flow Immunochromatography) Immunochromatography)
SVTH: Nguyễn Văn Phước 43 Lớp 07CSH Phương pháp này còn được gọi là thử nghiệm một bước nhanh (ROSA) để xác định mycotoxin. Đây là một phương pháp rất phổ biển để xác định nhanh mycotoxin và ước lượng nồng độ của chúng.
Một phương pháp sắc ký miễn dịch dòng chảy bên điển hình gồm các bước như sau: một miếng đệm để đưa mẫu vào; một vùng chứa những hạt màu (latex, vàng …) được phủ với kháng thể đơn dòng chống lại mycotoxin; một vùng của màng nitrocellulose cho phép sự di chuyển của những hạt cùng với mẫu mycotoxin; một đường kiểm tra giữ cố định mycotoxin; một đường đối chứng dương chứa kháng thể thứ cấp và một miếng đệm hấp phụ.
Một mẫu chứa mycotoxin được cho vào và di chuyển theo chuỗi. Khi đến vị trí tiếp hợp, mycotoxin gắn vào phức hợp hạt – kháng thể đối kháng mycotoxin. Bây giờ, những hạt chứa mycotoxin và những hạt tự do di chuyển vào vùng test – line. Những mycotoxin cố định bị bắt giữ nên chỉ có những hạt tự do hình thành nên màu trong khi những hạt mang mycotoxin tiếp tục di chuyển.
Sự hiện diện của mycotoxin trong mẫu càng cao thì các hạt chứa mycotoxin sẽ không thể gắn vào test line. Do đó, cường độ màu của test line càng nhạt chứng tỏ nồng độ mycotoxin trong mẫu càng cao.
SVTH: Nguyễn Văn Phước 44 Lớp 07CSH
SVTH: Nguyễn Văn Phước 45 Lớp 07CSH
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
Các độc tố nấm mốc phát triển mạnh trên các loại thực phẩm nông sản, thức ăn gia súc, gia cầm như ngô, lạc, đậu…
Trong quá trình phát triển, các nấm mốc sản sinh ra các độc tố gây bệnh cho con người và động vật tiêu thụ. Những độc tố do nấm mốc sinh ra có khả năng gây độc cấp tính và mãn tính đến các cơ quan gan, thận. Nhưng nguy hiểm nhất là gây ra các triệu chứng xơ gan, ung thư tế bào gan nguyên phát và gây ra các đột biến DNA.
Độc tố aflatoxin xâm nhập vào cơ thể qua đường ăn uống ở liều lượng cao trong thời gian ngắn. Gây ra triệu chứng cấp tính chuyên biệt của bệnh này bao gồm sự xuất huyết, hủy hoại gan cấp tính, phù, thay đổi trong đường tiêu hóa, hấp thu các sản phẩm trao đổi chất và chết.
Khi hấp thụ aflatoxin ở liều lượng tự thấp đến trung bình qua đường ăn uống trong thời gian kéo dài. Những ảnh hưởng này có thể là cận lâm sàng và khó có thể nhận biết. Một số triệu chứng như sự chuyển hóa thức ăn yếu, tỷ lệ tăng trưởng thấp hơn và có thể có xảy ra một số triệu chứng giống như ngộ độc aflatoxin cấp tính. Những triệu chứng này gây ngộ độc mãn tính trên gan có thể dẫn đến ung thư gan.
Độc tố OTA gây đột biến, ức chế miễn dịch và quái thai ở một số loài động vật và con người, các cơ quan mục tiêu của nó là những quả thận, gan. Độc tố OTA gây ức chế miễn dịch thông qua sự tác động quá trình chuyển hóa tế bào và gây tác hại cho ti thể.
Patulin là độc tố có khả năng gây ung thư cho người và động vật. Gây ra hoạt tính suy giảm miễn dịch liên quan tới các chứng xung huyết, gây loét niêm mạc, đặc biệt là niêm mạc ruột, độc tố này còn gây thiệt hại cho DNA hoặc nhiễm sắc thể ở người.
Fumonisin là độc tố có độc tính mạnh có thể gây các triệu chứng nhũng não, suy gan, gây mù, gây các triệu chứng bất bình thường cho tới tử vong ở ngựa (ELEM), ung thư gan ở chuột, bệnh gan ở gà, suy tim cấp ở khỉ..
SVTH: Nguyễn Văn Phước 46 Lớp 07CSH Do vậy vấn đề bảo quản lương thực thực phẩm là vấn đề hết sức quan trọng góp phần làm giảm tỉ lệ các bệnh mà các độc tố nấm mốc gây ra cho con người và vật nuôi.
4.2. KIẾN NGHỊ
Không nên sử dụng các thực phẩm đã bị hư hỏng, bị nhiễm nấm mốc, chúng ta nên có các biện pháp ngăn chặn nấm mốc phát triển trong quá trình thu hoạch nông sản. Trong quá trình lưu giữ các nông sản cần thường xuyên kiểm tra độ ẩm, nhiệt độ, sâu mọt và khử côn trùng trong kho để hạn chế sự nhiễm mốc.
Chúng ta cần áp dụng các phương pháp phân tích hiện đại, để phân tích các độc tố mycotoxin nhiễm trên nông sản, kịp thời ngăn chặn sự lây nhiễm của chúng để tránh sự thiệt hại nguồn nguyên liệu sản xuất thức ăn gia súc, gia cầm. Góp phần thúc đẩy nền kinh tế phát triển.