Patulin là hợp chất trao đổi bậc hai do các nấm mốc Penicillinum, Aspergillus và Bysscochlamys tạo nên. Các chủng tổng hợp patulin chủ yếu là các loài thuộc
Aspergillus như A. clavatus và A. giganteus. Trong số các Penicillinum, các loài tổng
hợp patulin nhiều nhất là P. exppansum, P. urticae, P. griceofulvum. Các loài nấm
SVTH: Nguyễn Văn Phước 29 Lớp 07CSH vào điều kiện luân canh và khí hậu, các hệ vi sinh vật này có thể bị thay đổi. Đặt biệt
A. clavatus thường ưa thích các môi trường có hàm lượng đạm cao. Trên các chất
đang thối rửa. Vì vậy, rất hay gặp A. clavatus ở các trại chăn nuôi trên phân gia súc
và gia cầm.
Hình 2.13: Nấm mốc A. clavatus
2.3.3.5. Hạn chế sự nhiễm Patulin
Một xu hướng kiểm soát patulin là ức chế và loại bỏ các nấm mốc trên các sản phẩm có khả năng bị nhiễm. Trong công nghệ, sự lựa chọn nguyên liệu sạch nấm mốc hoặc loại bỏ phần nhiễm nấm mốc là biện pháp hiệu quả nhất để hạn chế sự lây lan của nấm mốc trên khối nguyên liệu và loại trừ patulin.
Có thể bổ sung hỗn hợp ascorbic vào nước ép táo, tiến hành lên men dịch táo và sử dụng SO2 sát trùng nước quả để hạn chế sự phát triển nấm mốc và hạn chế sự tổng hợp patulin. Ngoài ra một trong những biện pháp rất hiệu quả được thử nghiệm là lợi dụng khả năng hoạt động của patulin, có khả năng tạo liên kết các nhóm – SH như cystein, thioglycolic và gluthion. Khi kết hợp với nhóm chất này, patulin trở nên không có hoạt tính sinh học và mất khả năng gây độc.
2.3.4. Fumonisin
Trong các mycotoxin, mối quan tâm về các fumonisin ngày càng tăng cao.
Fumonisin là độc tố mới được phát hiện gần đây do Fumonisin moniliorme tổng hợp
nên. Đây là nhóm độc tính cao với động vật và con người. Việc nhiễm fumonisin trong thức ăn cho người và gia súc ở quy mô trên toàn thế giới. Riêng tại mỹ, các báo cáo cho thấy 80 – 100% ngô bảo quản bị nhiễm fumonisin.
SVTH: Nguyễn Văn Phước 30 Lớp 07CSH
Hình 2.14: Nấm mốc Fumonisin nhiễm trên ngô
2.3.4.1. Cấu trúc Fumonisin
Fumonisin là nhóm hợp chất diester của acid tricarxylic với các rượu bậc cao khác nhau. Fumonisin chứa nhóm amin bậc nhất, tan trong nước và bền vững với nhiệt. Trong số các fumonisin, chỉ fumonisin B1, B2 và B3 được phát hiện với hàm lượng đáng kể cả trong điều kiện tự nhiên và điều kiện phòng thí nghiệm.
Hình 2.15: Cấu trúc hoá học phân tử Fumonisin
SVTH: Nguyễn Văn Phước 31 Lớp 07CSH Fumonisin B1 là độc tố có độc tính mạnh nhất trong số các fumonisin. Fumonisin B1 có thể gây các triệu chứng nhũng não, suy gan, gây mù, gây các triệu chứng bất bình thường cho tới tử vong ở ngựa (ELEM), ung thư gan ở chuột, bệnh gan ở gà, suy tim cấp ở khỉ..
Chỉ ở liều lượng 10 mg/kg thức ăn trong vòng 40-50 ngày, fumonisin đã có thể gây hội chứng ELEM. Fumonisin B1 có liên quan tới bệnh ung thư thực quản ở gà. Mới đây, Cơ quan Nguyên cứu Quốc tế về ung thư đã xếp fumonisin B1 vào nhóm 2B, nhóm các hợp chất gây ung thư cho người. Nguyên cứu ảnh hưởng của các fumonisin tới người, người ta thấy có sự liên quan của bệnh ung thư thực quản và việc sử dụng các lương thực nhiễm các fumonisin.
Độc tính của fumonisin B1 liên quan mật thiết tới các hiệu ứng lên sự trao đổi chất các sphingolipid, bao gồm quá trình tổng hợp mới, tích luỹ các sphingolipid tự do, quá trình thải loại các sphingoid tự do, tăng hàm lượng các sản phẩm lipid và sphingosin. Các hiệu ứng dẫn tới hàng loạt các phản ứng sinh hoá gây ra các sự nhiễm độc khác nhau.
Các nhà khoa học Mỹ đã tiến hành thí nghiệm cho chuột ăn thức ăn nhiễm fumonisin và phát hiện rằng các cơ quan đích của độc tố này là gan và thận.
2.3.4.3. Cơ chế hoạt động của Fumonisin
Cấu trúc của fumonisin gần giống với cấu trúc của sphingosine, điều này cho phép giả định là fumonisin có thể ảnh hưởng tới trao đổi chất của sphingosin trong cơ thể. Sphingosin là các tiền chất của mọi sphingolipid, bao gồm sphingomyelin, ceramid và gangliosid.
Cơ chế hoạt động của fumonisin không dựa trên hoạt tính biến dưỡng và cũng không có bằng chứng nó và các sản phẩm thủy phân của nó bị biến dưỡng bởi enzyme phase I và II. Fumonisin có một nhóm amino đầu tiên ở vị trí C2 ức chế
ceramide synthase, kết quả là ngăn cản sự sinh tổng hợp de novo của ceramide và
biến dưỡng sphingolipid.
Kết quả của sự ức chế ceramide synthase là sự tích lũy của sphinganine (Sa) và ở mức độ thấp hơn là sphingosine (So) trong mô, huyết thanh và nước tiểu. Sự tích
SVTH: Nguyễn Văn Phước 32 Lớp 07CSH lũy sphingoid base và cùng với sự tăng tỷ lệ Sa:So trong mô dẫn đến sự biểu hiện của fumonisin ở động vật có vú, chim và cá. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Độc tính của fumonisin B1 liên quan mật thiết tới các hiệu ứng lên sự trao đổi chất các sphingolipid, bao gồm các quá trình sinh tổng hợp mới, tích lũy các sphingolipid tự do, quá trình thải loại các sphingolipid phức tạp, tăng cường phân giải các sphingoid tự do, tăng hàm lượng các lipid và sphingosin. Các hiệu ứng này dẫn đến hàng loạt các phản ưng sinh hóa gây ra các sự nhiễm độc khác nhau.
Hình 2.16: Tóm tắt sơ đồ biến dưỡng sphingolipid thể hiện sự ức chế của enzyme ceramide synthase (X) bởi fumonisin
Các fumonisin có tính đặc hiệu tới sự tổng hợp các sphingosine, thể hiện ở sự ức chế serin. Không phát hiện các hiệu ứng tương tự của fumonisin đến sự tổng hợp các phosphatidylserin, phosphatidylcholin và các acid béo.
Vị trí hoạt động của fumonisin là sphingosine và sphingosine N. transacetylase trong phản ứng kết hợp của thiolase với sphingosin và sphingosin để tạo thành dihydroceramid và ceramid.
SVTH: Nguyễn Văn Phước 33 Lớp 07CSH Do sự ức chế của fumonisin, số lượng tế bào gan giảm xuống 25% sau 24 giờ và 50% sau 4 ngày, các hoạt động của fumonisin nhạy cảm với tế bào gan hơn so với tế bào thận.
Sự nhiễm fumonisin lâu dài ở nồng độ cao có thể gây ra các ảnh hưởng ở mức tế bào hoàn toàn khác với sự ảnh hưởng của sphingolipid.
Do các tế bào não rất giàu sphingolipid nên các tổn thương thần kinh có thể do sự nhiễm độc fumonisin B1 gây nên. Hoạt tính gây ung thư của fumonisin B1cũng có thể do cơ chế ức chế tổng hợp sphingolipid gây nên vì các độc tố này kìm hãm các hoạt động của sphingosin thể hiện vai trò của tác nhân chống khối u nội bào.
2.3.4.4. Nấm mốc tổng hợp Fumonisin
Fumonisin chủ yếu do các nấm mốc thuộc giống Fusarium tổng hợp nên. Loài điển hình nhất trong số này là Fusarium moniliforme. Các chủng nấm mốc của loài
này, do Sheldon xác định vào năm 1904 khá phổ biến trong môi trường và thường nhiễm trong lương thực, đặt biệt là ngô.
Vào năm 1988, các đặc tính của fumonisin lần đầu tiên được xác định và các
sản phẩm trao đổi chất của nó lần đầu tiên được phát hiện trong canh trường F.
moniliforme. Trong số đó, một hợp chất được phát hiện thường xuyên nhất và ở nồng
độ cao nhất trong các canh trường của loài này hoặc thực phẩm mà đặc biệt là ngô
nhiễm F. moniliforme. Hợp chất này sau đó được đặt tên “fumonisin B1”.
Các nguyên cứu về sau này cho thấy rằng không chỉ có F. moniliforme tổng hợp nên fumonisin mà các chủng khác thuộc Fusarium cũng tham gia tổng hợp nên độc tố loại này bao gồm F. proliferatum, F. subglutinans, F. anthophilum, F. annulatum, F.
succisae, F. beomiforme, F. dlamini, F. napiforme và F. nygamai.
2.3.4.5 Hạn chế nhiễm Fumonisin
Fumonisin B1 bền với nhiệt, xử lý canh trường F. moniliforme ở 1000C, và sau đó để khô ở 600C trong 24h, nồng độ fumonisin B1 hầu như không bị thay đổi. cấu trúc fumonisin B1 có thể bị phá huỷ ở nhiệt độ trên 2200C. Vì thế các giải pháp thuỷ phân hoặc các biện pháp khác áp dụng cho aflatoxin là không hiệu quả đối với fumonisin, thậm chí còn làm tăng cường độc tính của độc tố này. Các nghiên cứu
SVTH: Nguyễn Văn Phước 34 Lớp 07CSH hiện đang tiến hành để xác định ảnh hưởng của các kỹ thuật chế biến tới độc tố này trong thực phẩm, con đường lây nhiễm và các khả năng khử độc tố có thể áp dụng cho các sản phẩm thực phẩm cho người hoặc thức ăn gia súc.
2.3.5. Tình hình nhiễm mycotoxin trong thực phẩm trên thế giới và Việt Nam Sự nhiễm độc tố nấm mốc trong nông sản đã trở thành vấn đề toàn cầu. Ví dụ: Ở Đức có 84% trên 1000 mẫu nông sản thực phẩm kiểm tra có nhiễm Tricothecene, 13% số mẫu lương thực như lúa mì, lúa mạch, yến mạch bị nhiễm ochratoxin. Ở Đan mạch 19 trên 33 mẫu ngũ cốc kiểm tra có nhiễm ochratoxin. Ở Ấn Độ có 8% số mẫu bánh dầu hướng dương kiểm tra có nhiễm đồng thời cả hai loại độc tố T-2 và ochratoxin. Ở Mỹ có rất nhiều mẫu bắp kiểm tra cho thấy có sự nhiễm vomitoxin (DON) ở mức 1000ppb. Ở Úc kiểm tra trên bắp thấy có cả 3 loại mycotoxin như: aflatoxin, fumonisin và zearalenon. Theo Tiến sĩ Bangalore (Ấn Độ) thì các loại mycotoxin khác nhau có ưu thế ở những vùng khác nhau trên thế giới: Ở Bắc Âu thì Ochratoxin và Vomitoxin (DON) là vấn đề đang được quan tâm nhất. Còn ở Nam Mỹ thì mycotoxin có ưu thế lại là Aflatoxin và Fumonisin.
Ở Việt Nam nhiều nơi ép dầu phọng bằng bọng thủ công, độ ẩm còn cao, sau đó xếp thành chồng. Giữa các lớp bánh dầu có độ ẩm cao là môi trường thích hợp cho nấm phát triển. Nếu kho trữ thức ăn lâu ngày không làm vệ sinh, diệt nấm thì trong không khí sẽ có rất nhiều bào tử nấm tấn công nhanh các nguyên liệu này sinh ra
nhiều độc tố trong thức ăn. Nấm sinh ra trong kho dự trữ phổ biến nhất là Aspergillus và Penicillium. Độc tố của chúng sinh ra chủ yếu là aflatoxin, sau đó là ochratoxin,
rubratoxin và citrinin. Nó gây tổn hại nặng trên động vật, làm hư gan, thận, tạo ra màng bọc ống tiêu hóa do tế bào niêm mạc bị chết bong ra giảm hấp thu dưỡng chất, có thể gây tử vong trên số lớn gia cầm con và heo con.
Riêng ở các trại gà giống, độc tố nấm còn gây ra chết phôi hàng loạt, tỷ lệ ấp nở giảm rất thấp. Theo kết quả kiểm tra 29 mẫu bánh dầu phọng và 25 mẫu bắp thì mức aflatoxin trong bánh dầu phọng 1.200 ppb (tối đa 5.000 ppb), trong bắp 205ppb (tối đa 600 ppb). Các nguyên liệu còn lại như đậu nành hạt khô và bánh dầu công nghiệp của nó, bánh dầu mè công nghiệp, khô dầu dừa công nghiệp, cám 50ppb.
SVTH: Nguyễn Văn Phước 35 Lớp 07CSH
Chương 3: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ MYCOTOXIN
Việc kiểm tra mycotoxin trong thực phẩm dựa trên các phương pháp phân tích vi sinh vật thực phẩm, các phương pháp phân tích sinh hoá, hoặc các phương pháp xét nghiệm bệnh lý động vật.
3.1. Phương pháp phân tích vi sinh vật
Các phương pháp vi sinh vật chủ yếu để phân tách các chủng nấm mốc sinh độc tố. Để phân lập các nấm mốc nhiễm trên thực phẩm, phương pháp phân lập trực tiếp hiệu quả hơn phương pháp gián tiếp đối với các sản phẩm dạng hạt. Hạt ngũ cốc được đặt trực tiếp lên môi trường thạch sau khi đã được làm sạch trong dung dịch tẩy clo 0,4% để loại bỏ chất bẩn trên bề mặt mà không ảnh hưởng tới nấm mốc. Đối với các sản phẩm dạng bột, có thể tiến hành đồng hoá hoặc lắc mẫu trong các dung môi thích hợp và sử dụng kỹ thuật pha loãng để xác định nấm mốc nhiễm trên sản phẩm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Vấn đề cơ bản khi phân tách nấm mốc nhiễm trên sản phẩm là sự phát triển rất
nhanh chóng của một số loài nấm như Mucor, Rhizopus và các loài Zygomycetes làm
cho việc phát hiện hoặc định lượng các nấm mốc khác sẽ khó khăn. Có thể sử dụng các môi trường nghèo như Potato Dextro agar hoặc môi trường có chứa chất ức chế một số nấm mốc như dicloran, hoặc sử dụng các môi trường chọn lọc để ức chế một
số nấm mốc có khả năng sinh sợi nhanh chóng như Rhizopus.
3.2. Phương pháp phân tích lý hoá
3.2.1. Phương pháp phát hiện nấm dưới đèn UV
Việc xác định AF được phán đoán bằng sự phát sáng của khuẩn lạc là rất khó khăn, không dễ phân biệt với các chủng không sinh aflatoxin nhẫm lẫn.
Thí nghiệm chẩn đoán sự hiện diện của AF trong khuẩn lạc nấm mốc là sự phát
lân quang của AF ở nhiệt độ phòng sau khi tắt đèn UV. Các chủng Aspergillus không
SVTH: Nguyễn Văn Phước 36 Lớp 07CSH Sự phát huỳnh quang và lân quang của AF dưới tia UV không phải là điều duy nhất để xác định AF. Ở bước sóng 365 nm, AFB1 và AFB2 được hoạt hóa và tạo thành AFB – 8,9 – epoxide. Sau đó gắn vào vị trí N7 trên phân tử guanine tạo thành 8,9 – dihydro – 2 – (N7 guanyl) – 3 – hydroxyaflatoxin B2. Cấu trúc của AF-DNA photoadduct tương đồng với AF-DNA adduct được hình thành trong điều kiện in vivo ở AFB2 đường tiêu hóa bởi cytochrome P450 ở gan. Sự hình thành dạng kép AF- DNA được xem như là bước đầu tiên hình thành ung thư được kích thích bởi AF.
Hình 3.1: Các dòng nấm mốc sinh độc tố và không sinh độc tố, (a): quan sát dưới ánh sáng bình thường; (b) tia UV 365 nm, vòng bao xung quanh chủng sinh độc tố (dưới); (c) phát lân quang ở nhiệt độ phòng ở 2,5 giây sau khi tắt đèn UV.
3.2.2. Xác định các nấm mốc sinh mycotoxin bằng PCR
Aflatoxin có ít nhất có 25 gene liên quan đến quá trình tổng hợp aflatoxin và sự
điều hòa của nó. Các primer liên quan đến các trình tự afl-2, aflD, aflM và aflP được sử dụng để dò tìm và phát hiện các dòng Aspergillus sinh độc tố aflatoxin như A.
flavus và A. parasiticus trong số các khuẩn lạc được phân lập hoặc trong quá trình ly
trích DNA từ thực phẩm và thức ăn gia súc.
Trong thời gian ngắn, DNA của Aspergillus được sử dụng như một khuôn để
khuếch đại các gene liên quan đến quá trình sinh tổng hợp AF. Trình tự của các đoạn được được khuếch đại nhận dạng các gene sinh tổng hợp AF. Tuy nhiên, sự hiện diện của các gene này chỉ phản ánh khả năng hiện diện của nấm mốc sản sinh ra aflatoxin.
SVTH: Nguyễn Văn Phước 37 Lớp 07CSH Sự sản xuất AF phụ thuộc vào nhiệt độ, ẩm độ, thành phần của môi trường dinh dưỡng, phase tăng trưởng và thời gian nuôi cấy. Gần đây, việc ứng dụng kỹ thuật RT-
PCR để xác định các chủng Aspergillus sinh aflatoxin dựa vào sự hiện diện của
mRNA liên quan đến các gene sinh tổng hợp AF. RT-PCR biểu thị sự hiện diện của nấm mốc sinh aflatoxin và của các enzyme sinh tổng hợp AF.
Kỹ thuật Multiplex RT-PCR sử dụng 4 – 5 cặp mồi để phát hiện aflD, aflO, aflP,
aflQ, aflR và aflS (aflJ) nhằm xác định các nấm mốc sinh độc tố.
3.2.3. Phương pháp ELISA
Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau:
1. Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt
2. Kháng thể - antibody (KT) biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme.
3. Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được.
Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa kháng nguyên – kháng thể. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ quyết định cường độ sáng phát ra.
Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng