Các phương pháp vi sinh vật chủ yếu để phân tách các chủng nấm mốc sinh độc tố. Để phân lập các nấm mốc nhiễm trên thực phẩm, phương pháp phân lập trực tiếp hiệu quả hơn phương pháp gián tiếp đối với các sản phẩm dạng hạt. Hạt ngũ cốc được đặt trực tiếp lên môi trường thạch sau khi đã được làm sạch trong dung dịch tẩy clo 0,4% để loại bỏ chất bẩn trên bề mặt mà không ảnh hưởng tới nấm mốc. Đối với các sản phẩm dạng bột, có thể tiến hành đồng hoá hoặc lắc mẫu trong các dung môi thích hợp và sử dụng kỹ thuật pha loãng để xác định nấm mốc nhiễm trên sản phẩm
Vấn đề cơ bản khi phân tách nấm mốc nhiễm trên sản phẩm là sự phát triển rất
nhanh chóng của một số loài nấm như Mucor, Rhizopus và các loài Zygomycetes làm
cho việc phát hiện hoặc định lượng các nấm mốc khác sẽ khó khăn. Có thể sử dụng các môi trường nghèo như Potato Dextro agar hoặc môi trường có chứa chất ức chế một số nấm mốc như dicloran, hoặc sử dụng các môi trường chọn lọc để ức chế một
số nấm mốc có khả năng sinh sợi nhanh chóng như Rhizopus.
3.2. Phương pháp phân tích lý hoá
3.2.1. Phương pháp phát hiện nấm dưới đèn UV
Việc xác định AF được phán đoán bằng sự phát sáng của khuẩn lạc là rất khó khăn, không dễ phân biệt với các chủng không sinh aflatoxin nhẫm lẫn.
Thí nghiệm chẩn đoán sự hiện diện của AF trong khuẩn lạc nấm mốc là sự phát
lân quang của AF ở nhiệt độ phòng sau khi tắt đèn UV. Các chủng Aspergillus không
SVTH: Nguyễn Văn Phước 36 Lớp 07CSH Sự phát huỳnh quang và lân quang của AF dưới tia UV không phải là điều duy nhất để xác định AF. Ở bước sóng 365 nm, AFB1 và AFB2 được hoạt hóa và tạo thành AFB – 8,9 – epoxide. Sau đó gắn vào vị trí N7 trên phân tử guanine tạo thành 8,9 – dihydro – 2 – (N7 guanyl) – 3 – hydroxyaflatoxin B2. Cấu trúc của AF-DNA photoadduct tương đồng với AF-DNA adduct được hình thành trong điều kiện in vivo ở AFB2 đường tiêu hóa bởi cytochrome P450 ở gan. Sự hình thành dạng kép AF- DNA được xem như là bước đầu tiên hình thành ung thư được kích thích bởi AF.
Hình 3.1: Các dòng nấm mốc sinh độc tố và không sinh độc tố, (a): quan sát dưới ánh sáng bình thường; (b) tia UV 365 nm, vòng bao xung quanh chủng sinh độc tố (dưới); (c) phát lân quang ở nhiệt độ phòng ở 2,5 giây sau khi tắt đèn UV.
3.2.2. Xác định các nấm mốc sinh mycotoxin bằng PCR
Aflatoxin có ít nhất có 25 gene liên quan đến quá trình tổng hợp aflatoxin và sự
điều hòa của nó. Các primer liên quan đến các trình tự afl-2, aflD, aflM và aflP được sử dụng để dò tìm và phát hiện các dòng Aspergillus sinh độc tố aflatoxin như A.
flavus và A. parasiticus trong số các khuẩn lạc được phân lập hoặc trong quá trình ly
trích DNA từ thực phẩm và thức ăn gia súc.
Trong thời gian ngắn, DNA của Aspergillus được sử dụng như một khuôn để
khuếch đại các gene liên quan đến quá trình sinh tổng hợp AF. Trình tự của các đoạn được được khuếch đại nhận dạng các gene sinh tổng hợp AF. Tuy nhiên, sự hiện diện của các gene này chỉ phản ánh khả năng hiện diện của nấm mốc sản sinh ra aflatoxin.
SVTH: Nguyễn Văn Phước 37 Lớp 07CSH Sự sản xuất AF phụ thuộc vào nhiệt độ, ẩm độ, thành phần của môi trường dinh dưỡng, phase tăng trưởng và thời gian nuôi cấy. Gần đây, việc ứng dụng kỹ thuật RT-
PCR để xác định các chủng Aspergillus sinh aflatoxin dựa vào sự hiện diện của
mRNA liên quan đến các gene sinh tổng hợp AF. RT-PCR biểu thị sự hiện diện của nấm mốc sinh aflatoxin và của các enzyme sinh tổng hợp AF.
Kỹ thuật Multiplex RT-PCR sử dụng 4 – 5 cặp mồi để phát hiện aflD, aflO, aflP,
aflQ, aflR và aflS (aflJ) nhằm xác định các nấm mốc sinh độc tố.
3.2.3. Phương pháp ELISA
Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau:
1. Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt
2. Kháng thể - antibody (KT) biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme.
3. Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được.
Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa kháng nguyên – kháng thể. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ quyết định cường độ sáng phát ra.
Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu.
Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên chưa biết. Thông thường kháng nguyên được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate).
- Phương thức cố đinh không đặc hiệu: kháng nguyên gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa
- Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): kháng nguyên được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra
Kháng thể đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp kháng thể - kháng nguyên có thể sảy ra. Nếu kháng thể được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang
SVTH: Nguyễn Văn Phước 38 Lớp 07CSH học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện kháng nguyên cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng kháng thể thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), kháng nguyên cần xác định sẽ được nhận biết qua kháng thể thứ cấp này.
Giữa các bước của ELISA, các protein và các kháng thể không đặc hiệu, kháng thể không gắn với kháng nguyên sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa". Sau bước "rửa" cuối cùng, chỉ còn kháng thể liên kết với kháng nguyên được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với kháng thể trong phức hợp kháng thể - kháng nguyên. Phản ứng phát quang (biến đổi cơ chất) sẽ sảy ra.
Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của ELISA.
a) Phương pháp ELISA gián tiếp (indirect ELISA) gồm các bước chính: Chuyển kháng nguyên đã biết lên bề mặt cứng ( được gọi chung là các đĩa). Kháng nguyên sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết. Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào các giếng khác. Kháng nguyên chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu kháng nguyên chuẩn.
SVTH: Nguyễn Văn Phước 39 Lớp 07CSH Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa.
Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. Kháng thể sẽ kết hợp với các kháng nguyên đã được cố định mà không kết hợp với protein của huyết thanh.
Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một kháng thể còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện kháng nguyên đã gắn với enzyme).
Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ. Thêm cơ chất enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại).
Nhược điểm cơ bản: Bước cố định kháng nguyên không có tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa vì vậy kháng thể (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của điwax. Sandwich ELISA hạn chế được nhược điểm này.
b)Sandwich ELISA
Phương pháp được sử dụng để phát hiện kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ bản sau:
(1) Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn kháng thể
(2) Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt. (3) Phủ mẫu chứa kháng kháng nguyên cần xác định
(4) Rửa đĩa, kháng kháng nguyên không được gắn kết sẽ bị rửa trôi (5) Thêm các kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên cần chẩn đoán
(6) Thêm kháng thể thứ cấp đã được gắn với enzym (kháng thể thứ cấp đặc hiệu cho kháng thể sơ cấp ở bước 5)
SVTH: Nguyễn Văn Phước 40 Lớp 07CSH (8) Thêm cơ chất. Enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện.
(9) Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa... qua đó xác định sự có mặt và hàm lượng kháng thể.
Hình 3.3: Kháng nguyên gắn với kháng thể
c) ELISA cạnh tranh
Việc xác định và định lượng mycotoxin được xác định bằng kỹ thuật ELISA cạnh tranh.
Các giếng trong kỹ thuật ELISA được gắn một kháng thể sơ cấp chống lại mycotoxin. Các tác nhân phát hiện là một phức hợp đồng hóa trị của mycotoxin này và một enzyme thường sử dụng là horseradish peroxidase và alkaline phosphatase.
Các tác nhân này được trộn chung với mẫu dịch chiết của mycotoxin và phức hợp này được cho vào trong giếng. Trong giếng đối chứng (không chứa mycotoxin trong mẫu), phức hợp mycotoxin – enzyme có thể gắn lên các kháng thể sơ cấp và sau đó thêm các cơ chất tạo màu, kết quả là hiện màu trong mẫu. Trong các giếng kiểm tra, các phân tử mycotoxin tự do trong dịch chiết cạnh tranh với các phức hợp
SVTH: Nguyễn Văn Phước 41 Lớp 07CSH gắn trên các kháng thể sơ cấp. Nồng độ mycotoxin càng cao, phức hợp gắn trên kháng thể sơ cấp càng tí dẫn đến màu trong giếng càng nhạt.
Hình 3.4: Phương pháp ELISA cạnh tranh
3.2.4. Phương pháp sắc kí lớp mỏng (Thin layer chromato graphi-TLC)
Phương pháp sắc kí lớp mỏng được sử dụng rộng rãi để xác định hàm lượng aflatoxin lần đầu tiên vào những năm 1960. Người ta sử dụng các bản mỏng được tráng bởi silicagel, để xác định aflatoxin.
Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là chloroforin: methnol và choloroform : aceton. Việc thêm nước vào hệ thống dung môi sẽ làm tăng khả năng hòa tan aflatoxin.
Hệ dung môi gồm nước: aceton : chloroform( 1:5;12:88) được đánh giá có khả năng hòa tan aflatoxin tốt nhất. Các bản mỏng đã được chảy qua các dung môi chạy được đưa vào bởi đèn tử ngoại (UV) 365 nm.
Các vết mẫu phân tích tạo màu huỳnh quang xanh da trời hay xanh lá cây. Và có độ dài Rf được so sánh với các vết mẫu phân tích chuẩn. Phương pháp này có thể được xác định lượng từ 3-4.10-4micromet(0.3-0.4mg).
Nhược điểm của phương pháp là phụ thuộc vào người phân tích. Khi so sánh giữa mẫu và các vết của độc tố chuẩn có thể có sự sai lệch kết quả từ 20-30%
SVTH: Nguyễn Văn Phước 42 Lớp 07CSH 3.2.5. Phương pháp sắc kí lỏng cao áp (High ferformane liquid
chromatorgaphy-HPLC)
HPLC là một sắc ký cột (column chromatograph ) đi kèm với một detector nhạy để có thể phát hiện được các chất tách ra trong quá trình chạy sắc ký. Với những tiến bộ kỹ thuật về cột, detector đã chuyển sắc ký cột thành phương pháp phân tích có tốc độ nhanh và hiệu suất cao.
Loại này cần phải có hệ thống bơm cao áp để đẩy pha động với áp suất cao đến khoảng 30Mpa (300 atm) nhằm tạo dòng chảy với lưu lương vài ml/ phút. Số lượng mẩu phân tích bằng HPLC chỉ cần khoảng 20microlit. Phương pháp HPLC sử dụng cả hai pha: Pha bình thường và pha phản.
Hệ thống này dựa trên sự hấp thụ tia tím (uv) và xác định cường độ huỳnh quang. Mẫu phân tích được tác bằng chloroform: nước. Ly tâm chất tác dụng làm sạch qua silicagel pha bình thường sử dụng cột nhối silicagel 0.5m và pha động sử dụng bezen: acetonitrit: acid formic. Giới hạn xác định là 0.5 micromet/kg.
Hình 3.5: Phương pháp sắc kí lỏng cao áp
3.2.6. Phương pháp sắc ký miễn dịch dòng chảy bên (Lateral Flow Immunochromatography) Immunochromatography)
SVTH: Nguyễn Văn Phước 43 Lớp 07CSH Phương pháp này còn được gọi là thử nghiệm một bước nhanh (ROSA) để xác định mycotoxin. Đây là một phương pháp rất phổ biển để xác định nhanh mycotoxin và ước lượng nồng độ của chúng.
Một phương pháp sắc ký miễn dịch dòng chảy bên điển hình gồm các bước như sau: một miếng đệm để đưa mẫu vào; một vùng chứa những hạt màu (latex, vàng …) được phủ với kháng thể đơn dòng chống lại mycotoxin; một vùng của màng nitrocellulose cho phép sự di chuyển của những hạt cùng với mẫu mycotoxin; một đường kiểm tra giữ cố định mycotoxin; một đường đối chứng dương chứa kháng thể thứ cấp và một miếng đệm hấp phụ.
Một mẫu chứa mycotoxin được cho vào và di chuyển theo chuỗi. Khi đến vị trí tiếp hợp, mycotoxin gắn vào phức hợp hạt – kháng thể đối kháng mycotoxin. Bây giờ, những hạt chứa mycotoxin và những hạt tự do di chuyển vào vùng test – line. Những mycotoxin cố định bị bắt giữ nên chỉ có những hạt tự do hình thành nên màu trong khi những hạt mang mycotoxin tiếp tục di chuyển.
Sự hiện diện của mycotoxin trong mẫu càng cao thì các hạt chứa mycotoxin sẽ không thể gắn vào test line. Do đó, cường độ màu của test line càng nhạt chứng tỏ nồng độ mycotoxin trong mẫu càng cao.
SVTH: Nguyễn Văn Phước 44 Lớp 07CSH
SVTH: Nguyễn Văn Phước 45 Lớp 07CSH
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
Các độc tố nấm mốc phát triển mạnh trên các loại thực phẩm nông sản, thức ăn gia súc, gia cầm như ngô, lạc, đậu…
Trong quá trình phát triển, các nấm mốc sản sinh ra các độc tố gây bệnh cho con người và động vật tiêu thụ. Những độc tố do nấm mốc sinh ra có khả năng gây độc cấp tính và mãn tính đến các cơ quan gan, thận. Nhưng nguy hiểm nhất là gây ra các triệu chứng xơ gan, ung thư tế bào gan nguyên phát và gây ra các đột biến DNA.
Độc tố aflatoxin xâm nhập vào cơ thể qua đường ăn uống ở liều lượng cao trong thời gian ngắn. Gây ra triệu chứng cấp tính chuyên biệt của bệnh này bao gồm sự xuất huyết, hủy hoại gan cấp tính, phù, thay đổi trong đường tiêu hóa, hấp thu các sản phẩm trao đổi chất và chết.
Khi hấp thụ aflatoxin ở liều lượng tự thấp đến trung bình qua đường ăn uống trong thời gian kéo dài. Những ảnh hưởng này có thể là cận lâm sàng và khó có thể nhận biết. Một số triệu chứng như sự chuyển hóa thức ăn yếu, tỷ lệ tăng trưởng thấp hơn và có thể có xảy ra một số triệu chứng giống như ngộ độc aflatoxin cấp tính. Những triệu chứng này gây ngộ độc mãn tính trên gan có thể dẫn đến ung thư gan.
Độc tố OTA gây đột biến, ức chế miễn dịch và quái thai ở một số loài động vật và con người, các cơ quan mục tiêu của nó là những quả thận, gan. Độc tố OTA gây ức chế miễn dịch thông qua sự tác động quá trình chuyển hóa tế bào và gây tác hại cho ti thể.
Patulin là độc tố có khả năng gây ung thư cho người và động vật. Gây ra hoạt tính suy giảm miễn dịch liên quan tới các chứng xung huyết, gây loét niêm mạc, đặc biệt là niêm mạc ruột, độc tố này còn gây thiệt hại cho DNA hoặc nhiễm sắc thể ở người.
Fumonisin là độc tố có độc tính mạnh có thể gây các triệu chứng nhũng não, suy gan, gây mù, gây các triệu chứng bất bình thường cho tới tử vong ở ngựa (ELEM), ung thư gan ở chuột, bệnh gan ở gà, suy tim cấp ở khỉ..
SVTH: Nguyễn Văn Phước 46 Lớp 07CSH Do vậy vấn đề bảo quản lương thực thực phẩm là vấn đề hết sức quan trọng góp