2.4.1.1. Nguyên tắc
Nuôi cấy tăng sinh khối trong môi trường canh peptone kiềm, phân lập trên môi trường phân lập đặc trưng. Quan sát chọn những khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa cấy.
Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện và ít tốn kém. Tuy nhiên nhược điểm của nó là mất thời gian để thực hiện.
2.4.1.2. Cách thực hiện
− Lấy mẫu: chọn ngẫu nhiên 2 – 3 con tôm (cá) trong ao nuôi có dấu hiệu nhiễm khuẩn.
− Lấy máu tôm (cá): mỗi con 0,1ml, sau đó nhỏ lên các đĩa chứa môi trường TCBS, dàn đều khắp bề mặt môi trường, mỗi con cấy lên một đĩa. Ủ trong tủ ấm ở 300C trong 24 giờ.
− Tiến hành thử nghiệm các đặc tính sinh hóa của Vibrio sp. như khả năng sử dụng các đường glucose, sorbitol, maltose, sucrose, lactose, galactose; khả năng sử dụng Citrate như nguồn carbon duy nhất trên môi trường Simons Citrate Agar; khả năng sinh gar của glucose, kiểm tra khả năng lên men và oxy hóa; khả năng phân giải gelatin; khả năng sử dụng Nitrate; phản ứng Indol hóa; khả năng sử dụng các acid amin.
Hình 2.46: Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio sp. trên môi trường TCBS.
2.4.2. Phương pháp miễn dịch học – ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assays) Assays)
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Kỹ thuật ELISA có thể được sử dụng để phát hiện bệnh phát sáng do V.harveyi trên tôm, mẫu nước và có thể xác định tất cả các dòng Vibrio sp… Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên tắc bắt dính đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể và gồm các bước cơ bản sau:
− Kháng nguyên chưa biết được gắn trên một bề mặt.
− Kháng thể biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme.
− Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được.
Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa kháng nguyên – kháng thể. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ quyết định cường độ sáng phát ra.Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu.
Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên chưa biết. Thông thường kháng nguyên được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate).
− Phương thức cố định không đặc hiệu: kháng nguyên gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa.
− Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): kháng nguyên được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra.
Kháng thể đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp kháng nguyên – kháng thể có thể sảy ra.Nếu kháng thể được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện kháng nguyên cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng kháng thể thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), kháng nguyên cần xác định sẽ được nhận biết qua kháng thể thứ cấp này.
Giữa các bước của ELISA, các protein và các kháng thể không đặc hiệu, kháng thể không gắn với kháng nguyên sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa". Sau bước "rửa" cuối cùng, chỉ còn kháng thể liên kết với kháng nguyên được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với kháng thể trong phức hợp kháng nguyên – kháng thể. Phản ứng phát quang (biến đổi cơ chất) sẽ sảy ra.Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của ELISA. Có những phương pháp ELISA như sau:
2.4.2.1. ELISA gián tiếp (indirect ELISA)
Chuyển kháng nguyên đã biết lên bề mặt cứng (được gọi chung là các đĩa). Kháng nguyên sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết.
+ Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào các giếng khác. Kháng nguyên chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu kháng nguyên chuẩn.
+ Thêm dung dịch protein không tương tác (non – interacting protein) như albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả
mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blocking" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa.
+ Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. Kháng thể sẽ kết hợp với các kháng nguyên đã được cố định mà không kết hợp với protein của huyết thanh.
+ Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một kháng nguyên còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện kháng nguyên đã gắn với enzyme).
+ Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ.
+ Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại).
Hình 2.47: ELISA gián tiếp.
2.4.2.2. Sandwich ELISA
Phương pháp được sử dụng để phát hiện kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ bản sau (quy trình có thể được thay đổi trong nhiều trường hợp):
+ Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn kháng thể.
+ Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt. + Phủ mẫu chứa kháng kháng nguyên cần xác định.
+ Rửa đĩa, kháng kháng nguyên không được gắn kết sẽ bị rửa trôi. + Thêm các kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên cần chẩn đoán.
+ Thêm KT thứ cấp đã được gắn với enzym (kháng thể thứ cấp đặc hiệu cho kháng thể sơ cấp ở bước 5).
+ Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi.
+ Thêm cơ chất. Enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện.
+ Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa... qua đó xác định sự có mặt và hàm lượng kháng thể.
Hình 2.48: Các bước trong Sandwich ELISA. (1) Phủ đĩa bằng kháng thể (2) Thêm mẫu cần xác định kháng nguyên. Kháng nguyên (nếu có) sẽ gắn với kháng thể; (3) kháng thể dùng để phát hiện được thêm vào và kết hợp với Kháng nguyên; (4) Thêm kháng thể thứ cấp liên kết với enzyme. Kháng thể thứ cấp sẽ gắn với kháng thể dùng để phát hiện; (5) Thêm cơ chất. Enzym sẽ làm biến đổi cơ chất và phát tín hiệu có
thể phát hiện và đo được.
2.4.2.3. ELISA cạnh tranh (Competitive ELISA)
Các giếng trong kỹ thuật ELISA được gắn một kháng thể sơ cấp chống lại kháng nguyên. Các tác nhân phát hiện là một phức hợp đồng hóa trị của kháng nguyên này và một enzyme thường sử dụng là horseradish peroxidase và alkaline phosphatase.
Các tác nhân này được trộn chung với mẫu dịch chiết của kháng nguyên và phức hợp này được cho vào trong giếng. Trong giếng đối chứng (không chứa kháng nguyên trong mẫu), phức hợp kháng nguyên – enzyme có thể gắn lên các kháng thể sơ cấp và sau đó thêm các cơ chất tạo màu, kết quả là hiện màu trong mẫu. Trong các
giếng kiểm tra, các phân tử kháng nguyên tự do trong dịch chiết cạnh tranh với các phức hợp gắn trên các kháng thể sơ cấp. Nồng độ kháng nguyên càng cao, phức hợp gắn trên kháng thể sơ cấp càng tí dẫn đến màu trong giếng càng nhạt. Thí nghiệm này nhanh, dễ dàng thực hiện.
Hình 2.49: ELISA cạnh tranh.
2.4.3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Karl Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới. Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme polymerase. Hiện nay có thể sử dụng kỹ thuật khuếch đại DNA để chuẩn đoán nhanh bệnh do Vibrio sp. trong vài giờ mà không mất nhiều thời gian để phân lập vi khuẩn. Nguyên tắc của phương pháp này là phát hiện một đoạn DNA đặc hiệu cho Vibrio sp.
Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA mới từ mạch khuôn. Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi, là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh. Trong một phản ứng PCR để khuyếch đại một trình tự đặc biệt nào đó, ta cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự đó để thiết kế các mồi bổ sung ở hai đầu mạch bao gồm một mồi xuôi (sense primer) và một mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gene. Một khi được cung cấp hai mồi bổ sung ở hai đầu, phản ứng sẽ cho ra hàng loạt bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi đó.
Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:
− Giai đoạn biến tính: trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao trong vòng 30 giây – 1phút, thường là ở 940C.
− Giai đoạn bắt cặp: ở giai đoạn này, nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng từ 30° – 70°C khoảng 40 giây – 1 phút.
− Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên đến 720C cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thưòng kéo dài từ 20 giây đến nhiều phút.
Trong phản ứng PCR, chu kỳ ba giai đoạn sẽ được lặp lại nhiều lần, mỗi lần làm tăng số lượng bản sao lên gấp đôi. Sự khuếch đại của phản ứng là theo cấp số nhân và theo tính toán, sau 30 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu.
Hình 2.50: Các giai đoạn trong phản ứng PCR.
2.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÒNG NGỪA VÀ ĐIỀU TRỊ59 59
2.5.1. Biện pháp phòng bệnh tổng hợp2.5.1.1. Cải tạo và vệ sinh môi trường nuôi 2.5.1.1. Cải tạo và vệ sinh môi trường nuôi
Cải tạo ao trước khi ương nuôi: tháo cạn, vét bùn (rửa đáy ao), phơi khô (hoặc rửa chua) và khử trùng ao nuôi với mục đích là:
− Diệt địch hại và sinh vật là vật nuôi trung gian sinh vật cạnh tranh thức ăn của tôm, cá, như các loài cá dữ, cá tạp, giáp xác, côn trùng, nòng nọc, sinh vật đáy..
− Diệt sinh vật gây bệnh cho tôm, như các giống loài vi sinh vật: Vi khuẩn, nấm và các loài ký sinh trùng.
− Cải tạo chất đáy làm tăng các muối dinh dưỡng, giảm chất độc tích tụ ở đáy ao. − Đắp lại lỗ rò rỉ, tránh thất thoát nước trong ao, xoá bỏ nơi ẩn nấp của sinh vật hại tôm.
Vệ sinh môi trường ao nuôi trong quá trình nuôi: vệ sinh môi trường nuôi bằng phương pháp cơ học, hóa học, sinh học.
− Vệ sinh môi trường nuôi bằng phương pháp cơ học: trong quá trình nuôi thương phẩm thức ăn thừa và phân đã gây ô nhiễm môi trường nuôi, đặc biệt là thời gian cuối chu kỳ nuôi. Những sản phẩm khí độc như: H2S, NH3 ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ của tôm nuôi. Biện pháp dùng hệ thống máy quạt nước để tăng cường hàm lượng oxy hoà tan trong ao, đặc biệt là tầng đáy, tạo điều kiện cho vi sinh vật hiếu khí phát triển sẽ làm giảm thiểu lượng khí độc trong ao. Sục khí mạnh cũng sẽ làm các khí độc thoát ra khỏi ao, đồng thời gom các chất thải trong ao vào một nơi nhất định, giúp rút các các chất thải ra khỏi ao nuôi tốt hơn.
− Vệ sinh bằng phương pháp hóa học: vệ sinh môi trường nước nuôi tôm thường xuyên bằng vôi bột (vôi nung để hả) tuỳ theo pH của nước ao. Vôi có tác dụng cung cấp Ca2+ cho ao, ổn định pH, khử trùng làm sạch nước ao. Nếu pH <7 dùng 2 kg vôi/100m3; pH từ 7 – 8,0 có thể dùng 1 kg vôi/100m3, định kỳ bón từ 2 – 4 lần/tháng; pH >8,0 dùng bột đá vôi (CaCO3) hoặc vôi đen – CaMg(CO3)2 để bón là 1kg/100m3. Đối với ao nuôi thâm canh có thể dùng vôi đen – Dolomite (Ca và Mg), chú ý chất lượng vôi đen và nguồn gốc. Trong quá trình nuôi tôm nên thường xuyên bón vôi 2 – 4 lần/tháng với liều lượng 1 – 2kg/100m3 nước(100 – 200kg/ha với độ sâu 1m). Dùng một số hoá dược có tính oxy hoá mạnh phun vào ao: thuốc tím (KMnO4) nồng độ 2 – 5g/m3 hoặc Benzalkonium Chloride (BKC) nồng độ từ 0,1 – 0,5 g/m3 để tham gia vào quá trình oxy hoá các khí độc (H2S, NH3) thành các vật chất đơn giản không độc.
− Vệ sinh bằng phương pháp sinh học: khi nuôi qui mô lớn có thể dùng một số chế phẩm sinh học để cải thiện môi trường nuôi tôm. Tác dụng của chế phẩm sinh học: cải thiện chất lượng nước, ổn định pH, cân bằng hệ sinh thái trong ao; loại các chất thải chứa nitrogen trong ao nuôi, những chất thải này gây độc cho động vật thủy sản,sau đó chúng được chuyển hóa thành sinh khối làm thức ăn cho các động vật thủy sản; giảm bớt bùn ở đáy ao; giảm các vi khuẩn gây bệnh như: Vibrio sp,
Aeromonas sp và các loại virus gây bệnh khác; hạn chế sử dụng hóa chất và kháng sinh.
2.5.1.2. Tiêu diệt nguồn gốc gây bệnh
Khử trùng cơ thể con giống trước khi thả nuôi: ao đã được tẩy dọn sạch sẽ và khử trùng đáy ao, nước mới tháo vào ao cũng đã lọc kỹ nhưng con giống có thể mang mầm bệnh vào ao hồ. Do vậy nguồn con giống thả vào thuỷ vực cần tiến hành kiểm dịch, nếu có sinh vật gây bệnh ký sinh trên cơ thể tôm thì tuỳ theo kết quả kiểm tra mà chọn thuốc trị bệnh cho thích hợp.
Khử trùng thức ăn: Thức ăn là động vật tươi nên rửa sạch, tốt nhất là nấu chín. Phân hữu cơ cần ủ với 1% vôi sau đó mới sử dụng. Xung quanh nơi cho ăn, thức ăn thừa thối rữa gây nhiễm bẩn, tạo điều kiện cho sinh vật gây bệnh phát triển. Do đó thức ăn thừa phải vớt bỏ hoặc làm sạch và khử trùng địa điểm cho ăn. Làm sạch nơi cá (tôm) đến ăn có thể dùng thuốc nào hay số lượng nhiều ít còn tuỳ thuộc vào chất nước, độ sâu, nhiệt độ nước, diện tích nơi cho ăn và tình hình phát sinh bệnh.
Khử trùng dụng cụ: sinh vật gây bệnh có thể theo dụng cụ lây lan bệnh từ ao bể bị bệnh sang ao, bể tôm khỏe. Vì vậy dụng cụ của nghề nuôi nên dùng riêng biệt từng ao, bể. Nếu thiếu thì sau đó khi sử dụng xong phải có biện pháp khử trùng mới đem dùng cho ao, bể khác. Dụng cụ đánh bắt dụng cụ bằng gỗ, quần áo khi lội ao phải dùng dung dịch Ca(OCl)2 200ppm để ngâm ít nhất 1 giờ và rửa sạch mới dùng.
2.5.1.3. Tăng cường sức đề kháng bệnh
Nguyên nhân gây bệnh xâm nhập vào những cơ thể có phát sinh ra bệnh hay không còn tuỳ thuộc vào yếu tố môi trường và bản thân cơ thể vật nuôi. Nếu vật nuôi có sức đề kháng tốt có khả năng chống đỡ lại yếu tố gây bệnh nên không mắc bệnh hoặc bệnh nhẹ. Ngược lại khả năng chống đỡ yếu, dễ dàng nhiễm bệnh. Do đó một
trong những khâu quan trọng để phòng bệnh cho vật nuôi phải tăng cường sức đề kháng cho vật nuôi. Cho ăn theo phương pháp “4 định”:
− Định chất lượng thức ăn: Thức ăn dùng cho ăn phải tươi, sạch sẽ không bị mốc, ôi thối, không có mầm bệnh và độc tố. Thành phần dinh dưỡng thích hợp đối với yêu cầu phát triển cơ thể trong các giai đoạn.
− Định số lượng thức ăn: dựa vào trọng lượng cơ thể để tính lượng thức ăn, thường sau khi cho ăn sau 2 giờ kiểm tra nếu ăn hết là lượng vừa phải. Nếu ăn thừa