2.3.2.1. Lịch sử phát hiện bệnh
Bệnh do vi khuẩn Vibrio đã được phát hiện rất sớm từ năm 1970 bởi Tukiash khi bệnh xảy ra và gây chết với tỷ lệ > 50% trên đối tượng nuôi thủy sản là cua xanh (Callinectes sapidus). Đến năm 1977, Fisher đã thông báo các loài tôm hùm châu Mỹ như: Homarus americarus, H. gammarus... hay tôm hùm châu Á (Panulirus homarus, P. ornatus...) đều có thể bị nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio. Kết quả này cũng được thông báo bởi Roald và Bowser, 1981.
Ngoài ra, Lioo và các ctv của ông đã thông báo hiện tượng tôm sú bị bệnh đỏ thân có liên quan đến thức ăn thối rữa. Nhưng có một số quan điểm khi nghiên cứu và phát hiện bệnh đỏ thân trong các ao nuôi tôm Sú ở Philippines với thức ăn tổng hợp (công nghiệp) cho rằng: bệnh đỏ thân xảy ra có liên quan đến khi độc trong ao. Năm 1990, ông Hassawai cho rằng tác nhân gây ra bệnh đỏ thân ở Thái Lan là do phẩy khuẩn. Ở Việt Nam, có một số tác giả cho rằng nguyên nhân gây ra bệnh đỏ thân là do tôm ăn Artemia và tảo già. Tuy nhiên theo nghiên cứu của viện nuôi trồng thuỷ sản 3 thì bệnh đỏ thân do một giống vi khuẩn Vibrio alginolyticus gây ra trên tôm sú. Cho đến nay bệnh này được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Nghiên cứu của Newman và Feng, 1982 cho biết loài cua đá (Callinectes irroratus) cũng có thể bị chết do cảm nhiễm Vibrio ở 20oC sau 24h.
Ở Việt Nam, ngay từ những năm 1989 – 1990 các nhà nghiên cứu đã phát hiện rằng bệnh Vibriosis, đặc biệt là bệnh phát sáng rất phổ biến trong các trại sản xuất tôm sú giống và trong ao nuôi thương phẩm (Đỗ Thị Hòa, 1995,1997). Những năm gần đây, nghề nuôi cá và động vật thân mềm nước mặn phát triển và bệnh Vibriosis
đã trở thành bệnh thường gặp và gây nhiều tác hại cho nghề nuôi thủy sản.
Vi khuẩn thuộc giống Vibrio sống vào ký sinh trên cơ thể động vật thủy sản đều gây ra một số dấu hiệu bệnh lý nhất định. Cho đến nay, một số tác giả cho rằng
Vibrio là tác nhân đầu tiên gây ra các bệnh cho tôm. Ngược lại một số tác giả lại cho rằng: Vibrio chỉ là tác nhân thứ 2. Bệnh này xảy ra như là kết quả của các điều kiện khác: tôm bị bệnh truyền nhiễm hay các bệnh về dinh dưỡng, tôm bị thương hoặc điều kiện môi trường khắc nghiệt. Trong nghiên cứu bệnh động vật thuỷ sản phân lập
Vibrio từ mẫu bệnh không khó nhưng xác định vai trò của chúng trong một bệnh không đơn giản và cảm nhiễm trở lại khó thành công do không tạo được các yếu tố điều kiện để bệnh bùng phát.
2.3.2.2. Phân loại
Bộ: Eubacterriales
Họ: Vibrionaceae
Giống: Vibrio
Loài: V.alginolyticus; V.parahaemolyticus; V.anguillarum; V.harveyi; V. salmonicida; V.splendidus.
2.3.2.3. Đặc điểm chung
Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae là những loài vi khuẩn Gram (-), hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6µm. Chúng không sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu vi khuẩn.
Tất cả những loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio đều là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, vi khuẩn không phát triển trong môi trường không muối (NaCl) và không sinh H2S. Chúng mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129.
Về cơ bản, các loài vi khuẩn này đều có mặt trong môi trường nước, đặc biệt là nước biển và cửa sông, Na+ kích thích cho sự phát triển của tất cả các loài Vibrio và nhiều loài là nhu cầu tuyệt đối. Hầu hết các mẫu phân lập từ bệnh vỏ và viêm ruột của tôm trưởng thành đều gặp loài V.alginolyticus; V. parahaemolyticus, V.anguillarum.
Hình 2.37: Khuẩn lạc của V.alginolyticus và V.parahaemolyticus
2.3.2.4. Đặc điểm dịch tễ
a. Đặc điểm phân bố
− Địa lý: Bệnh Vibriosis có thể quan sát được ở khắp mọi nơi có nghề nuôi động vật thủy sản nước lợ và nước mặn. Sự phân bố của bệnh này rộng khắp thế giới, tập trung ở châu Á, châu Phi và châu Mỹ. Từ mẫu bệnh phát sáng của ấu trùng và hậu ấu trùng, các tác giả đã phân lập được những loại khác nhau của giống vibrio. Như ở Philippines, C.L.pilogo, M.C.L Baticados; E.R.Crus và L.de Lapena đã phân lập được 2 loài V.harveyi và V.splendidus. Trong khi đó ở Thái Lan, người ta lại cho
rằng tác nhân là V.parahaemolyticus. Ở Việt Nam, một số cán bộ của trường Đại Học Thủy Sản đã phân lập từ tôm bệnh được 2 loài vi khuẩn là V.alginolyticus và
V.parahaemolyticus.
− Ký chủ: Hầu như các loài động vật thủy sản nuôi nước lợ, mặn đều có thể bị nhiễm và chịu tác hại của bệnh Vibriosis như: các loài tôm he (Penaeus spp.) và tôm thẻ (Metapenaeus spp.), các loài tôm hùm châu Mỹ (Homarus spp.) và tôm hùm châu Á (Panulirus spp.), các loài cua biển như cua xanh, cua đá...
− Giai đoạn phát triển: bệnh có thể xảy ra ở các giai đoạn ấu trùng, hậu ấu trùng, ấu niên, cơ thể trưởng thành, ở đàn bố mẹ của các loài tôm, cua... Tuy vậy, tùy theo từng loại bệnh mà vi khuẩn Vibrio có thể gây nặng ở giai đoạn này và nhẹ hơn ở giai đoạn kia. Ví dụ: Bệnh phát sáng do Vibrio harveyi có thể xảy ra ở nhiều giai đoạn khác nhau, nhưng tác hại nặng nhất là giai đoạn tiền ấu trùng Zoae và Mysis.
− Con đường lan truyền: Trong hệ thống nuôi thuỷ sản vi khuẩn Vibrio xâm nhập vào ao theo một số con đường: nguồn nước, dụng cụ dùng, tôm mẹ hoặc tôm giống, thức ăn, đặc biệt là thức ăn tươi sống Artemia và chúng có thể nằm sẵn ở thành bể hay dưới đáy ao.
b. Mùa vụ xuất hiện bệnh
Mùa vụ xuất hiện bệnh do vi khuẩn Vibrio tùy thuộc theo loài và địa điểm nuôi. Theo nghiên cứu của một số tác giả nước ngoài và Việt Nam, Vibrio sp. tìm thấy phổ biến trong nước biển và vùng ven bờ, trong bể ương ấu trùng, bể ương tảo và bể ương Artemia.
Nhìn chung: Vi khuẩn Vibrio phân chia cơ thể rất nhanh ở độ mặn 10 – 40ppt (phát triển tốt nhất ở độ mặn 20 – 30ppt), lây lan nhanh ở nhiệt độ cao (mùa nóng), phát triển nhanh ở nơi có nhiều chất hữu cơ, oxy thấp và pH 7 – 9.
Trong bể ương lượng vi khuẩn Vibrio tăng theo thời gian nuôi, tầng đáy cao hơn tầng mặt, do đó biện pháp kỹ thuật xiphong đáy có tác dụng giảm mật độ Vibrio
trong bể ương. Mật độ vi khuẩn Vibrio tăng nhanh rõ rệt khi thời tiết thay đổi, vào các thời điểm biển động do bão, gió mùa hay áp thấp nhiệt đới (Đỗ Thị hòa, 1997) hoặc theo con nước của thủy triều (nước cường, nước ròng). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
c. Tác hại của bệnh
Bệnh do Vibrio sp. gây ra ở tôm có thể xảy ra ở dạng cấp tính hoặc mãn tính, trong trường hợp cấp tính, tỷ lệ chết có thể là 100%.
2.3.2.5. Dấu hiệu bệnh lý
a. Dấu hiệu lâm sàng
Tôm bị nhiễm Vibrio sp. ở trạng thái không bình thường, hôn mê, lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn. Tôm có thể nổi lên mặt ao, dạt bờ hay kéo đang bơi lòng vòng. Vỏ tôm bị mềm và xuất hiện các vết thương hoại tử, ăn mòn trên vỏ và các phần phụ.
Hình 2. 38:Đuôi tôm sú bị mòn cụt do nhiễm vi khuẩn Vibrio.
Khi vi khuẩn này cảm nhiễm trên vỏ kitin và mang có thể gây ra các vết thương tổn màu nâu đen do kitin đã bị ăn mòn và viêm nhiễm. Hội chứng này gọi là bệnh vỏ hay bệnh nhiễm nâu. Vỏ tôm có sự biến đổi thành màu đỏ hay màu xanh.
Hình 2.39: Lớp vỏ kitin của tôm mềm và có màu xanh.
Ấu trùng tôm và tôm giống có sự phát sáng ở phần giáp đầu ngực, nhìn trong tối sẽ thấy thân tôm phát sáng. Sau đó sẽ kèm theo hiện tượng lắng đáy, chết hàng loạt khi nhiễm V. parahaemolyticus và V. harveyi.
Hình 2.40: Hiện tượng phát sáng ở ấu trùng tôm sú.
Xuất hiện các điểm đỏ ở gốc râu, ngực, ở thân hay ở các phần phụ của ấu trùng giáp xác khi nhiễm V. alginolyticus. Xuất hiện vùng mờ ở phần cơ bụng, tôm bỏ ăn và xuất hiện sắc tố nâu đen trên mặt lưng của phần bụng gây nên những khoảng tối sáng khác với tôm bình thường. Các cơ quan phần phụ chuyển màu đỏ.
b.Dấu hiệu bệnh tích
Vi khuẩn Vibrio cũng có thể nhiễm ở gan tụy, ruột và một số vùng cơ của tôm. Tuy nhiên, khi giải phẩu cơ thể tôm bệnh chúng ta không thể phát hiện được dấu hiệu bệnh tích của tôm bệnh.
Sau đây là một số bệnh đặc trưng do Vibrio sp. gây ra trên tôm
2.3.2.6. Bệnh phồng đuôi
a. Tác nhân gây bệnh
Bệnh phồng đuôi ở tôm tuy không lan thành dịch bệnh lớn nhưng cũng ảnh hưởng khá lớn đến năng suất nuôi. Ao nuôi với mật độ dày có rất nhiều khả năng gặp phải bệnh này. Nguyên nhân chính là do số lượng thức ăn dư thừa và vật chất khác tích tụ ở đáy ao tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển, chủ yếu là vi khuẩn thuộc giống Vibrio mà chiếm đa số là Vibrio parahaemolyticus.
Hình 2.41: Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus.
b.Dấu hiệu nhiễm bệnh
Vi khuẩn có khả năng tạo ra loại enzyme chitinase phân hủy lớp chitin của lớp vỏ tôm. Mép đuôi trở nên đen và nhìn giống như bị đốt cháy. Có nơi phồng len hoặc sưng bên trong – chứa nhiều dịch. Những vùng đen hoặc sưng là nơi chứa nhiều vi khuẩn. Các vi khuẩn này không thể phát triển tới các nơi khác của cơ thể, nếu tôm lột vỏ trước khi vi khuẩn xâm nhập vào lớp màng trong, phần đen của đuôi sẽ bị loại khỏi qua lớp vỏ cũ. Nếu quá trình nhiễm bệnh ở dạng mãn tính, lớp mô cơ của đuôi sẽ chết và hư hỏng, lúc này trở nên màu đỏ và sưng tấy.
Hình 2.42: Chân đuôi tôm sú bị phồng.
2.3.2.7. Bệnh đỏ dọc thân
a. Tác nhân gây bệnh
Nước và đáy ô nhiễm nặng, thức ăn thừa quá nhiều, công tác vệ sinh kém, nhiễm vi khuẩn Vibrio mà chủ yếu là Vibrio alginolyticus.
b. Dấu hiệu nhiễm bệnh
Bệnh xảy ra làm tôm có những chấm đỏ dọc thân sau đó lan dần hết toàn thân. Ở Thái Lan tôm ấu trùng khi bị bệnh này nghiêm trọng sẽ có hiện tôm nhợt nhạt mất khả năng bơi lội sau 2 – 3 ngày tôm có thể chết.
Hình 2.43: Tôm sú bị bệnh đỏ dọc thân.
2.3.2.8. Bệnh phát sáng
a. Đặc điểm của vi khuẩn V.harveyi
Nhóm Vibrio phát sáng là một phần của hệ vi sinh vật tự nhiên cư trú ở vùng ven bờ biển, được tìm thấy trên bề mặt và cà trên ruột của động vật sống ở biển. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Vibrio harveyi và V. splendidus là 2 loài vi khuẩn phân lập từ các mẫu tôm ấu trùng và hậu ấu trùng bị bệnh phát sáng. Tuy nhiên Vibrio harveyi mới được xem là loài vi khuẩn chủ yếu gây bệnh phát sáng trên tôm.
Vibrio harveyi thuộc giống Vibrio, họ Vibrionaceae. Đặc điểm chung của
V.harveyi là vi khuẩn gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6µm, gây ra hiện tượng phát sáng sinh học trên tôm trong môi trường biển. V.harveyi không có mối quan hệ cộng sinh với bất kỳ sinh vật biển nào, nó di chuyển bằng roi.
Hình 2.44: Vi khuẩn Vibrio harveyi.
Quan sát trong bóng tối các đĩa cấy V.harveyi trên môi trường phân lập đặc trưng thấy khuẩn lạc phát ra ánh sáng xanh nhạt. V.harveyi có khả năng kháng chịu
rất nhiều loại kháng sinh thông thường như: erythromycin, penicillin, streptomycin và sulfadiazine. V.harveyi có khả năng tổng hợp enzyme catalase nên không bị tiêu diệt bởi H2O2.
Bảng 2.2 : Đặc điểm sinh hóa của Vibrio harveyi.
Đặc điểm Vibrio harveyi
Nhuộm gram - Di động + Thử Oxydase + Phát sáng + Phát triển ở 4°C - Phát triển ở 37°C +
Phát triển ở môi trường 0% NaCl -
Phát triển ở môi trường 3% NaCl +
Phát triển ở môi trường 7% NaCl +
Mẫn cảm 0/129 (150µg) S
Phát triển trên TCBS xanh
Thử O/F Glucose +/+
Thủy phân Arginine -
Lysine Decarbonxylase + Orinithine Decarboxylase - Sử dụng Citrate - Urease - Khử Nitrate + Indol + Sinh H2S - Methyl red + 45
Voges – Proskauer -
Dịch hóa Gelatin +
Axit hóa Arabinose -
Axit hóa Glucose +
Axit hóa Inositol -
Axit hóa Mannitol +
Axit hóa Salicin -
Axit hóa Sucrose -
Hiện nay vẫn chưa biết rõ về cơ chế gây bệnh của V.harveyi, Liu (1997) cho rằng protease, phospholipase hoặc hemolysin có thể giữ vai trò quan trọng trong việc gây bệnh, trong đó protease cystein giữ vai trò là ngoại độc tố chính chính đối với động vật thủy sản. Montero và Austin (1999) cho rằng lipopolysaccharide có thể hình thành nên độc tố gây chết của V.harveyi dòng E2 đối với tôm. Nhìn chung hemolysin của vi khuẩn đã được coi là yếu tố quan trọng của các Vibrio gây bệnh bằng cách gây nhiễm trùng máu và tiêu chảy ở vật chủ.
b.Phân tử tín hiệu Quorum Sensing ở Vibrio harveyi
Khái niệm quorum sensing
Quorum sensing là cơ chế thông tin liên lạc giữa tế bào với tế bào, phối hợp với sự biểu hiện gene trong tế bào vi khuẩn để đáp ứng lại mật độ tế bào bằng cách sản xuất, giải phóng và dò tìm các phân tử dấu hiệu nhỏ, được gọi là các phân tử autoinducer (Defoirdt et al., 2004; Tu and Bassler, 2007; Tinh et al., 2007). Hệ thống quorum sensing điều khiển một số quá trình ở vi khuẩn gây bệnh như sự phát sáng, sự tiếp hợp, tạo thành khối u, sự quần tụ bầy đàn, sự hình thành bào tử, sự ăn mòn sinh học, sản xuất các chất kháng kháng sinh và quan trọng nhất là sự hình thành biofilm và các nhân tố gây độc ở vi khuẩn như các enzyme thủy phân, độc tố, siderophore và các phân tử gắn kết (Defoirdt et al, 2004; Tinh et al, 2007).
Cơ chế hoạt động của hệ thống Quorum sensing (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ở V. harveyi, HAI – 1 (Harveyi Autoinducer – 1) là một AHL (Acyl Homoserine Lactone) và quá trình sinh tổng hợp của HAI – 1 bị thủy phân bởi enzyme LuxM. AI – 2 (Autoinducer – 2) là một furanosyl borate diester, quá trình sinh tổng hợp của nó bị phân hủy bởi enzyme LuxS (Defoirdt et al., 2004; Tu and Bassler, 2006). Trong khi đó, quá trình sinh tổng hợp CAI – 1(Cholerae Autoinducer – 1) bị phân hủy bởi enzyme CqsA (Tu and Bassler, 2006). Mỗi phân tử dấu hiệu
autoinducer được phát hiện bởi một protein kinase cảm biến histidine tự động phosphoryl hóa gắn trên màng tế bào khác nhau cho từng loại autoinducer, cụ thể là LuxN phát hiện HAI – 1, CqsS phát hiện CAI – 1, phức hợp LuxP – LuxQ phát hiện AI – 2. Tất cả 3 cảm biến này chuyển nhóm phosphate cho protein vận chuyển nhóm phosphate chứa histidine, LuxU và LuxU này sẽ chuyển nhóm phosphate cho protein điều hòa dựa vào σ54, LuxO. Trong điều kiện mật độ tế bào thấp (tức là nồng độ autoinducer không đáng kể), 3 sensor này hoạt động như một kinase và nhóm phosphate được chuyển đến LuxO. Khi đó, phức hợp LuxO∼P liên kết với σ54, ức chế sự biển hiện của gene mã hóa cho sự phát sáng (gene lux), vì thế không có sự phát sáng trong điều kiện này. Ở mật độ tế bào cao (nồng độ autoinducer có thể nhận ra được), sự tương tác của sensor với các autoinducer có cùng bản chất làm cho các sensor này chuyển từ phương thức hoạt động như một kinase sang phương thức hoạt động như một phosphatase dẫn đến quá trình khử phosphoryl hóa LuxO. Khi đó, LuxO bị bất hoạt, dẫn đến sự biểu hiện của operon lux và điều khiển trực tiếp hoặc gián tiếp tất cả các gene đích của hệ thống quorum sensing.
Cơ chế phân tử của sự kết nối với LuxO dẫn đến sự điều hòa của gene đích đã được xác định ở V. harveyi. Ở mật độ tế bào thấp, phức hợp LuxO∼P liên kết với σ54, hoạt hóa sự biển hiện của gene mã hóa cho 5 RNA điều hòa nhỏ (sRNA) được gọi là Qrr 1 – 5. sRNA làm mất tính ổn định của mRNA của luxR. Khi không có sự hiện diện của luxR, sự biểu hiện gene kiểm soát quorum sensing không xảy ra. Ở mật độ tế bào cao, quá trình dephosphoryl hóa làm bất hoạt LuxO, kết thúc quá trình sản xuất sRNA, giải thoát gene luxR khỏi sự ức chế cho phép sự điều hòa gene đích kiểm soát quorum sensing.
Gần đây, sRNA được xem là một nhân tố điều hòa quan trọng hiện diện ở nhiều