VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1. Vật liệu

- Nguồn vi khuẩn gây bệnh được phân lập từ các cây cà chua có biểu hiện triệu chứng nhiễm bệnh héo xanh điển hình.

- Nguồn vi sinh vật đối kháng được phân lập từ các mẫu thực vật như: Đất vùng rễ cà chua khỏe mạnh, đất ruộng trồng cà chua.

- Các môi trường phân lập vi khuẩn:

+ Môi trường TTC: Để nghiên cứu hình thái khuẩn lạc R. solanacearum

(Kelman, 1954) [7]: pepton 10 g; cazein thủy phân 1 g; glucoza 5 g; thạch 20 g; nước cất 1 lần 1000 ml; chỉnh pH= 7,0, khử trùng ở 0,5 at, 1210C, 20 phút, làm lạnh đến 600

C và thêm 5 ml 2 – 3 - 5 Triphenyl Tetrazolium Chloride 1%.

+ Môi trường 523: Để nuôi cấy R. solanacearum: Cao nấm men 4 g; cazein thủy phân 8 g; sucaroza 10 g; MgSO4.7H2O (6,25%) 5 ml; K2HPO4 12,5%) 16,3 ml; thạch 18 g; nước cất 1000 ml; chỉnh pH = 7,0.

+ Môi trường King B (KB): Để phân lập và thu sinh khối vi khuẩn đối kháng: Cao nấm men 5 g; pepton 20 g; glyxerin 5 ml; K2HPO4 (12,5%) 12 ml; MgS04.7H20 (6,25%) 25 ml; nước cất 1000 ml; chỉnh pH = 7,0

+ Môi trường CPG: Tuyển chọn các thể đột biến: Casaminoacid 1 g; pepton 10 g; glucoza 10 g; thạch 20 g; nước cất 1000 ml; chỉnh pH = 7,0.

- Các dung dịch đệm chủ yếu để tách ADN vi sinh vật.

+ Đệm CTAB: 100 mM Tris HCl, pH = 9,0; 20 mM NaEDTA, pH = 8,0; 1,4M NaCl; 2% Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB); 0,2% - mercapto ethanol.

+ Đệm gây tan tế bào “Lysis”: 50 mM Tris - HCl; 50 mM EDTA; 3% SDS; 1% 2 - mercapto ethanol; chloroform; TE : saturated phenol (1/1 phenol bão hoà trong TE); TE: 10 mM Tris - HCl (pH = 8,0); 1 mM EDTA; 3M NaOAc

(pH = 8,0); isopropanol, ethanol 70%. + Dung dịch mẹ:

* Dung dịch phenol bão hoà TE.

* Dung dịch chloroform: isomyalcohol (24/1).

* Dung dịch TE (10 mM Tris – HCl; pH = 8,0; 1 mM EDTA).

+ Dung dịch đệm điện di 10xTBE: Tris Base: 108 g; axít boric 55 g; 0,5M EDTA (pH = 8,0) 40 ml; nước 1.000 ml.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phân lập và tuyển chọn chủng Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cà chua héo xanh cà chua

2.2.1.1. Thu mẫu và phân lập vi khuẩn gây bệnh

- Phương pháp thu mẫu bệnh: Chỉ thu mẫu ở những cây mới bị bệnh. Mỗi

thửa ruộng (khoảng 200 m2

) thu 2  5 đoạn thân sát gốc có kích thước 3 cm, giữ trong túi polyetilen. Ghi thời gian thu mẫu (ngày, tháng, năm), địa điểm, giống cây,.... Sau mỗi lần cắt, dụng cụ cắt phải được tẩy trùng bằng cồn 70% để tránh làm lây lan mầm bệnh giữa các mẫu với nhau [1].

- Phương pháp xử lý mẫu: Sau khi được rửa sạch bằng nước máy và sát trùng bề mặt bằng cồn 70%, các mẫu bệnh được bổ dọc và cắt những phần bị nhiễm bệnh (có màu nâu nhạt), ngâm trong ống eppendorf chứa 1 ml nước cất vô trùng, sau 20 phút loại bỏ đoạn thân nhiễm bệnh ra khỏi ống dịch thôi vi khuẩn. Những ống dịch này được bảo quản ở nhiệt độ 40

C.

- Phương pháp phân lập vi khuẩn Ralstonia solanacearum: Tiến hành pha

loãng dịch thôi vi khuẩn sao cho có thể thu được các khuẩn lạc riêng biệt sau khi cấy gạt trên môi trường TTC, ủ ở nhiệt độ 28C  2C. Theo dõi và ghi kết quả sau 24, 48 và 72 giờ. Từ mỗi nhóm hình thái khuẩn lạc tiến hành chọn 3 đến 5 khuẩn lạc để cấy vạch trên môi trường 523. Sau 24  48 giờ ủ

ở nhiệt độ 28C  2C, tiến hành chọn những khuẩn lạc có kiểu hình thái điển hình và giữ trong nước cất vô trùng để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

2.2.1.2. Đánh giá tính độc của R. solanacearum

R. solanacearum là loài vi khuẩn gây bệnh héo xanh điển hình và có

khả năng biến dị nhanh. Chúng luôn có xu hướng mất tính độc và hình thái khuẩn lạc của chúng có thể thay đổi từ dạng chảy sang dạng không chảy khi bảo quản trong nước cất, hiện tượng này quan sát được khi nuôi cấy chủng trên môi trường TTC [93].

Vì vậy, khâu chọn những khuẩn lạc chảy và thử tính độc của chúng là rất cần thiết trong việc duy trì, bảo quản các chủg vi khuẩn có tính độc. Thí nghiệm này được thực hiện bằng cách lây nhiễm nhân tạo chủng vi khuẩn cần kiểm tra trên dòng cà chua chỉ thị L - 390.

Sau khi cấy trên môi trường 523, vi khuẩn R. solanacearum được

nhiễm vào những cây cà chua có 5  6 lá thật bằng phương pháp cắm tăm (dùng tăm nhọn vô trùng lấy một ít tế bào cắm vào nách lá cây cà chua) [92], [150], cây được chăm sóc ở điều kiện tự nhiên, nhiệt độ trung bình 280C 

300C, ghi kết quả số cây chết và sống sót hàng ngày. Dựa vào kết quả về mức độ chết của cây cà chua để đánh giá mức độ độc của chủng vi khuẩn cần nghiên cứu.

Bảng 2. Đánh giá độc tính vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Mức độ độc Triệu chứng của cây

0 Không có triệu chứng

1 Một lá héo hoặc héo từng phần 2 Hai tới ba lá héo hoặc héo từng phần 3 2/3 số lá héo

4 Tất cả lá bị héo xanh 5 Cây chết (lá bị khô)

2.2.1.3. Nhận dạng vi khuẩn R. solanacearum bằng kỹ thuật PCR

* Tách ADN

Các chủng R. solanacearum được nuôi cấy trên môi trương TTC

không màu trong 24  48 giờ ở 300C để thu sinh khối. Sinh khối vi khuẩn được chứa trong ống eppendorf có thể tích 1,5 ml với 0,5 ml nước cất vô trùng.

- Thu tế bào: Ống sinh khối vi khuẩn được ly tâm ở vận tốc 12000 vòng/phút, 3 phút, gạn bỏ phần nước, thu tủa.

- Làm tan tế bào: Hoà tan tủa tế bào vi khuẩn trong 250 l dung dịch đệm (40 mM Tris - acetat, pH 7,8; 20 mM Na - acetat; 1 mM EDTA; SDS 1%; 50 g/ml RNAaza). Votex kỹ để vi khuẩn phân tán đều trong dịch đệm.

- Bổ sung 66 l dung dịch 5 M NaCl, votex kỹ trong 2 phút. - Ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút, 10 phút ở 40C.

- Chiết xuất phân lớp: Chuyển phần dịch sang một ống eppendorf khác, bổ sung chloroform với thể tích 1/1, trộn đều bằng cách đảo nhẹ ống trong 2 phút.

- Ly tâm ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 3 phút. Trong ống phân thành 3 lớp, ADN có ở lớp trên (pha nước), chuyển pha trên sang ống mới.

- Tủa ADN: Bổ sung cồn 100% lạnh vớ tỉ lệ thể tích 2,5/1 so với thể tích dung dịch trong ống. Giữ ở - 40C trong thời gian 1  2 giờ.

- Ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút, 10 phút để thu phần tủa ADN. - Rửa ADN kết tủa: Bổ sung 200  300 l cồn 80%. Lặp lại bước này 1  2 lần. Sau đó làm khô tự nhiên phần tủa trong buồng cấy vô trùng hoặc sấy khô trong máy hút chân không, hoà tan ADN trong 50 l đệm 1xTE (10 mM Tris - HCl, 1 mM EDTA, pH = 8,0) và giữ ở - 200C.

* Nhân bản gen (PCR)

Hỗ trợ phản ứng PCR đựợc thiết lập như sau:

Thành phần của hỗn hợp phản ứng nhân bản gen Thể tích (l) 10 x đệm nhân gen (10 x PCR buffer - 500mM KCl; 100

mM Tris - HCl pH = 9,3; 1% Triton X - 100) 5 25 mM MgCl2 3 10 mM dCTP 1 10 mM dGTP 1 10 mM dATP 1 10 mM dTTP 1 Primer AU P.759 0.5 Primer AU P.760 0.5 ADN khuôn 2

50 U/l Taq ADN polymeraza 0.1

Nước cất vô trùng 29,9

Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR như sau: Bước 1: 950

C - 2 phút. Bước 2 (30 chu kỳ: 940C - 30 giây, 550C - 30 giây, 72 0C - 1 phút. Bước 3: 720C - 5 phút.

Trong tất cả các bước của PCR, trước khi sử dụng dung dịch Taq- polymeraza trong glyxerol 50% phải được trộn nhẹ nhàng bằng pipet vài lần tránh tạo bọ khí vì sự oxy hoá sẽ làm bất hoạt Taq - polymeraza. Đồng thời, hỗn hợp phản ứng cần được pha trong các dụng cụ chưa bao giờ chứa ADN.

Chạy điện di ở đệ thế 30 ÷ 40V, 60 ÷ 80 mA. Nhuộn ADN bằng Ethidium Bromide (EtBr), quan sát và chụ ảnh dưới ánh sáng đèn tử ngoại.

2.2.2. Phƣơng pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng [5] kháng [5]