L ỜI MỞ ĐẦU
2.2.3 Phương pháp xác định hiệu giá huyết thanh
a. Nguyên lí
Dựa vào khả năng trung hòa đặc hiệu của nọc rắn bằng kháng thể kháng nọc rắn
khi trình tự các nồng độ pha loãng khác nhau của huyết thanh kháng nọc rắn được
trung hòa với một lượng nọc rắn đặc hiệu nhất định. Sau đó đem tiêm trên chuột
nhắt trắng 18-20g. Hiệu giá được xác định bằng cách so sánh sự chênh lệch giữa LD50 độc lực của nọc rắn với nọc rắn đã được trung hòa bằng nồng độ huyết thanh tương ứng.
b. Chuẩn bị
- Chuột làm thí nghiệm có trọng lượng 18-20g, phân vào mỗi hộp 4-6 con tùy vào thiết kế thí nghiệm và đánh dấu chuột theo từng nồng độ pha huyết thanh đối
với mẫu và nồng độ nọc rắn đối với nọc.
- Chuẩn bị tất cả các dụng cụ cần thiết như : ống nghiệm, nước muối sinh lí, pipet, … để pha nọc rắn cũng như huyết thanh.
c. Phương pháp tiến hành
Pha dung dịch nọc rắn có 20LD50 dùng trung hòa huyết thanh:
Từ độc tố nọc rắn được Viện Vắc Xin cung cấp với nồng độ 2800 LD50/ml ta
pha loãng 140 lần tạo nồng độ 20 LD50/ml.
Nọc rắn dùng để xác định hiệu giá trên chuột phải là nọc của loài rắn dùng để
gây miễn dịch ngựa sản xuất huyết thanh.
Pha nọc rắn xác định LD50
Tùy vào thiết kế thí nghiệm để tính hàm lượng nọc rắn cho một độ pha.
Pha nọc rắn theo độ pha loãng sau:
Với d=log 1,1=0.04
Bảng 2.6: Pha loãng nọc rắn dùng trung hòa huyết thanh.
Độ pha Độ pha loãng nọc rắn Nọc rắn 20LD50 (ml) Nước muối sinh lí 0,85% (ml) 1/12,1 10-0,78 1 11,1 1/11 10-0,74 1 10 1/10 10-0,70 1 9 1/9,1 10-0,66 1 8,1
Chú ý: Khi kiểm tra hiệu lực của kháng thể cần phải xác định đồng thời độc
lực của nọc rắn.
Phản ứng trung hòa xác định hiệu giá huyết thanh kháng nọc rắn
- Đối với huyết thanh có hiệu giá cao cần phải pha loãng ½ hoặc ¼ trước khi đưa vào trung hòa, các độ pha loãng của huyết thanh được chọn sao cho chứa tối
thiểu 2 điểm 0% và 100% số chuột chết.
- Phản ứng trung hòa giữa kháng huyết thanh và nọc rắn: Cách pha được tính
theo bảng sau. (tùy theo thiết kế thí nghiệm để chọn độ pha).
Bảng 2.7: Pha huyết thanh trung hòa giữa nọc rắn.
Lượng huyết thanh / 10 chuột (ml) Lượng huyết thanh / 1 chuột (ml) Thể tích huyết thanh (ml) Thể tích nước muối sinh lí (ml) Thể tích nọc rắn (ml) Hiệu giá lý thuyết LD50/ml 0,019 0,19 2,31 2,5 211 0,023 0,23 2,27 2,5 174 0,027 0,27 2,23 2,5 184 0,033 0,33 2,17 2,5 121 0,040 0,40 2,10 2,5 100 0,048 0,48 2,02 2,5 83 0,057 0,57 1,93 2,5 70 0,069 0,69 1,81 2,5 58 0,082 0,82 1,68 2,5 49 0,100 1,00 1,50 2,5 40 0,120 1,20 1,30 2,5 33 0,144 1,44 1,06 2,5 28 0,173 1,73 0,77 2,5 23 0,208 2,08 0,42 2,5 19 0,250 2,50 0,00 2,5 16
- Ủ ở 370C trong 30 phút. Tránh ánh sáng.
d. Thực hiện tiêm chuột :
+ Hỗn hợp chuẩn độ nọc rắn ( xác định LD50) được tiêm vào tĩnh mạch đuôi
của chuột với liều tiêm 0,5ml/ chuột. Bắt đầu tiêm từ độ pha loãng có nồng độ độc
tố thấp nhất đến độ pha loãng có nồng độ độc tố cao nhất.
+ Hỗn hợp huyết thanh - nọc rắn : (Xác định hiệu giá huyết thanh) được tiêm vào tĩnh mạch đuôi chuột với liều tiêm 0.5ml/ chuột. Bắt đầu tiêm từ độ pha loãng có nồng độ độc tố thấp nhất đến độ pha loãng có nồng độ độc tố cao nhất.
e. Theo dõi và tính kết quả
Theo dõi chuột
Chuột sau khi tiêm được theo dõi hàng ngày trong 48 giờ.
Tính kết quả
Kết quả được tính liều LD50 bảo vệ.
Xác định liều LD50 của nọc rắn đưa vào trung hòa với huyết thanh:
Tính kết quả theo công thức của Spearman-Barker
Log LD50 = Xo + d/2 - d∑Ri/n
T= antilog LD50
Xo: log của độ pha loãng mà tại đó gây ra 100% số chuột chết.
d: log của bậc pha loãng.
n: Số chuột trong mỗi độ pha.
∑Ri: Tổng số chuột chết trong mỗi mẫu thử.
Xác định liều LD50 bảo vệ của huyết thanh thử nghiệm:
Log PD50 = Xo + d/2 - d∑Ri/n
Xo: log của độ pha loãng huyết thanh cao nhất mà tại đó bảo vệ 100%chuột.
d: log của bậc pha loãng.
n: Số chuột trong mỗi độ pha.
∑Ri: Tổng số chuột sống trong mỗi mẫu thử.
Xác định hiệu giá huyết thanh (LD50/ml).
Hiệu giá huyết thanh = ( T-1)/PD50 × độ pha loãng huyết thanh mẫu thử