+ Phòng bệnh
Phòng bệnh bằng vệ sinh: chủ yếu là giữ vệ sinh chung, trong các thao tác sản khoa, ngoại khoa phải vô trùng, những vết thương phải ñiều trị ñể tránh trở thành chỗ xâm nhập của vi khuẩn gây nên nhiễm khuẩn nặng.
Phòng bệnh bằng vaccine: có thể dùng vaccine tụ cầu chết hoặc vaccine giải ñộc tố chế tạo từ các chủng phân lập tại ñịa phương nơi có dịch gọi là vaccine chuồng. Việc dùng vaccine phòng bệnh vẫn chưa ñạt hiệu quả cao nên ít ñược dùng.
+ Điều trị
Chữa bệnh bằng thuốc kháng sinh: do ñặc ñiểm của tụ cầu rất dễ kháng thuốc, hoặc gặp phải chủng kháng kháng sinh, nên khi dùng thuốc kháng sinh ta phải dùng kháng sinh ñồ. Những loại kháng sinh thường dùng là: nhóm beta lactamin (penicillin, methicillin, oxacillin), nhóm aminoside trong ñó thường dùng là kanamycin và gentamycin.
Chữa bệnh bằng vaccine: trong những trường hợp vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh, người ta có thể dùng vaccine ñể ñiều trị, thường dùng là vaccine tự liệu hoặc vaccine trị liệu.
Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Nội dung nghiên cứu
Để ñạt ñược những mục tiêu ñề ra tôi sẽ nghiên cứu những nội dung sau ñây: + Nghiên cứu chế tạo dẫn suất Chitosan cải biến nhằm nâng cao hoạt tính kháng khuẩn của chitosan.
+ Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các dẫn suất chitosan cải biến trong invitro.
+ Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dẫn suất chitosan cải biến trên thực phẩm.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Địa ñiểm nghiên cứu
- Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học Thực vật trường Đại học Tây Nguyên.
- Các chủng vi sinh vật: Thu thập từ Bộ môn Vi sinh, Đại học Y Dược Tp. HCM, bao gồm: Escherichia coli ATCC 25922; Staphylococcus aureus
ATCC 25923 (MSSA).
- Chitosan mức ñộ deacetyl hóa 90%, khối lượng phân tử 30 kDa, 300 kDa, 700 kDa, sản phẩm của Kitto life (Hàn Quốc).
- Các hoá chất khác như glucose, glucosamine, N- acetyl glucosamine, galactose, acid acetic là hóa chất tinh khiết.
2.2.3. Thiết kế thí nghiệm
2.2.3.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
* Vi khuẩn Escherichia coli và Staphilococcus aureus
+ Môi trường nuôi cấy
Vi khuẩn (Escherichia coli và Staphilococcus aureus) ñược nuôi cấy trong môi trường Nutrient Broth.
+ Phương pháp giữ giống và bảo quản
Vi khuẩn E. coli và S. aureus ñược nuôi cấy thường xuyên (1 tháng/1
lần) trong ống thạch nghiêng có chứa môi trường Nutrient Broth – agar. Giống ñược cấy vào các ống nghiệm sau 2 ngày sẽ ñưa vào tủ lạnh ñể bảo quản ở nhiệt ñộ 40C.
+ Phương pháp chuẩn bị giống ñể tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị 2 ống nghiệm chứa 10ml dung dịch môi trường Nutrient
Broth, ñem hấp khử trùng. Sau ñó cấy vi khuẩn E. coli và S. aureus vào ống
nghiệm, lắc ñều, ñem ủ trong tủ ấm ở nhiệt ñộ 370C. Sau 24h dùng ống giống
này ñể thực hiện thí nghiệm.
2.2.4. Các bước tiến hành
Trong phòng thí nghiệm, tiến hành lần lượt như sau:
+ Chuẩn bị giống vi sinh vật
Một ống E. coli + 10ml Nutrient Broth Một ống S. aureus + 10ml Nutrient Broth
Được cấy từ ống giống, ñem nuôi ở tủ giữ nhiệt với nhiệt ñộ 370C trong vòng 24 giờ.
+ Chuẩn bị môi trường
10ml môi trường Nutrient Broth/1 ống nghiệm. Hấp khử trùng ở 1210C
trong 10 phút.
+Thiết kế thí nghiệm
Trong một ống nghiệm chứa 10ml môi trường Nutrient Broth ñã hấp khử trùng, cho vào 0,1ml thể vẩn vi khuẩn (E. coli, S. aureus). Sau ñó bổ sung chitosan cải biến có khối lượng phân tử khác nhau (30 kDa, 300 kDa, 700 kDa, ñối chứng) với nồng ñộ 50ppm, 100ppm, 150ppm, 200ppm, 300ppm. Mỗi thí nghiệm thực hiện 3 ống nghiệm với 3 lần lặp lại, mẫu ñược nuôi cấy ở 370C trong 24h.
+ Các chỉ tiêu theo dõi
Sinh trưởng của vi khuẩn trong môi trường có bổ sung chitosan ñược xác ñịnh bằng phương pháp ño ñộ ñục trên máy quang phổ ở bước sóng 620 nm sau thời gian nuôi cấy 24h.
2.2.5. Phương pháp nghiên cứu cải biến chitosan
2.2.5.1. Phương pháp cải biến chitosan-glucose * Chuẩn bị thí nghiệm * Chuẩn bị thí nghiệm
- Chitosan 30 kDa, 300 kDa, 700 kDa
Pha chitosan 1%: Cân 1g chitosan pha trong 100ml axít acetic 1% - Glucose 1%: Cân 1g glucose pha trong 100ml nước cất
Chitosan gắn glucose ñược thực hiện bằng phản ứng Maillard theo phương pháp của Kanatt (2007). Qui trình ñược tóm tắt như sau
- 1% chitosan ñược chuẩn bị trong 1% acid acetic băng.
- Phức hợp chitosan-glucose(CGC) ñược chuẩn bị bằng cách hấp khử trùng chitosan 1% và glucose 1% trong 15 phút.
Phản ứng Maillard:
Công thức 1(CT1): Chitosan/glucose theo tỷ lệ nồng ñộ 1 :1 ; Công thức 2(CT2): Chitosan/glucose theo tỷ lệ nồng ñộ 2 :1 ; Công thức 3(CT3): Chitosan/glucose theo tỷ lệ nồng ñộ 5 :1 ;
Phản ứng ñược thực hiện ở nhiệt ñộ 1210C trong vòng 15 phút ; mỗi công thức làm 3 ống và 3 lần lặp lại.
Thí nghiệm cũng ñược thực hiện 3 loại chitosan có khối lượng phân tử khác nhau là 30 kDa, 300 kDa và 700 kDa.
Các chỉ tiêu theo dõi:
- Mức ñộ gắn của glucose lên mạch chitosan ñược xác ñịnh bằng phương pháp quang phổ Spectrophotometer theo phương pháp của Ajandouz (2001). Pha loãng thích hợp với nước cất và ño ñộ hấp phụ ở các bước sóng 420nm.
2.2.5.2. Phương pháp cải biến chitosan-glucosamine
Phương pháp cải biến tương tự như phương pháp chitosan-glucose ñược tổng hợp bằng phản ứng Maillard theo phương pháp của Kanatt (2005).
Công thức 1(CT1): Chitosan/glucosamine theo tỷ lệ nồng ñộ 1 : 1; Công thức 2(CT2): Chitosan/glucosamine theo tỷ lệ nồng ñộ 2 : 1; Công thức 3(CT3): Chitosan/glucosamine theo tỷ lệ nồng ñộ 5 : 1; Phản ứng ñược thực hiện ở nhiệt ñộ 1210C trong vòng 15 phút; mỗi công thức làm 3 ống và 3 lần lặp lại.
Thí nghiệm cũng ñược thực hiện 3 loại chitosan có khối lượng phân tử khác nhau là 30 kDa, 300 kDa và 700 kDa.
Các chỉ tiêu theo dõi:
Mức ñộ gắn của glucose lên mạch chitosan ñược xác ñịnh bằng phương pháp quang phổ Spectrophotometer theo phương pháp của Ajandouz (2001). Pha loãng thích hợp với nước cất và ño ñộ hấp phụ ở các bước sóng 420nm.
2.2.6. Phương pháp nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các dẫn suất chitosan cải biến chitosan cải biến
Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan cải biến ñược thực hiện bằng phương pháp ño ñộ ñục và phương pháp khuếch tán trên ñĩa.
2.2.6.1. Xác ñịnh khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp ño ñộ ñục
Các vi khuẩn chủng gây bệnh E. coli ATCC 25922; S. aureus ATCC
25923 (MSSA), ñược nuôi cấy trong 10ml môi trường Nutrient Broth, các ống nghiệm ñược bổ sung các sản phẩm chitosan cải biến có khối lượng phân tử khác nhau (chitosan-glucose; chitosan-glucosamine) với nồng ñộ từ 0 (ñối chứng có bổ sung 0,015ml axít acetic), 50, 100, 150, 200 và 300 ppm. Vi khuẩn ñược nuôi cấy ở nhiệt ñộ 370C trong 24h. Sinh trưởng của vi khuẩn ñược xác ñịnh bằng phương pháp ño ñộ ñục ở bước sóng 625 nm. Thí nghiệm gồm 6 công thức, lặp lại 3 lần.
2.2.6.2. Xác ñịnh khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñĩa
Các chủng vi khuẩn ñược cấy trên môi trường thạch ñĩa. Các dẫn suất chitosan cải biến ñược tẩm trên giấy thấm vô trùng có ñường kính 6mm với nồng ñộ bằng chỉ số MIC, ñặt nhẹ trên bề mặt ñĩa. Vi khuẩn ñược ủ ở nhiệt ñộ 370C trong 48h, ño kích thước vòng vô khuẩn.
Thí nghiệm gồm 4 công thức:
- Công thức 1: Bổ sung chitosan có khối lượng phân tử 30 kDa - Công thức 2: Bổ sung chitosan có khối lượng phân tử 300 kDa - Công thức 3: Bổ sung chitosan có khối lượng phân tử 700 kDa - Công thức 4: Đối chứng
Thí nghiệm gồm 4 công thức, lặp lại 3 lần.
2.2.7. Phương pháp thử nghiệm các dẫn suất chitosan cải biến trong bảo quản thực phẩm quản thực phẩm
Các dẫn suất chitosan cải biến có hoạt tính kháng khuẩn cao sẽ ñược thử nghiệm ñể bảo quản thực phẩm trên ñối tượng là thịt bò.
- Thịt bò ñược mua ở chợ về có màu hồng ñỏ tươi, mùi vị ñặc trưng của thịt tươi, có ñộ ñàn hồi tốt. Sau ñó ñược cắt thành từng miếng nhỏ khoảng từ 15 -30g/ miếng rồi ñem bảo quản bằng cách phun trực tiếp dung dịch chế phẩm lên miếng thịt và ñược bảo quản ở nhiệt ñộ phòng 20-250C và ở 50C.
Chỉ tiêu theo dõi:
Chỉ tiêu cảm quan: màu sắc, ñộ nhớt bề mặt, mùi sản phẩm sau các khoảng thời gian bảo quản 24, 48, 72, 96, 120, 144 h. Theo phương pháp cho ñiểm TCVN 7096:2002. Thịt giữ tươi ở nhiệt ñộ phòng thì cứ 6h lấy mẫu kiểm tra một lần và nhiệt ñộ 50C thì cứ 24h lấy mẫu kiểm tra một lần.
Sơ ñồ bố trí thí nghiệm như sau:
- Đối với chitosan-glucose có khối lượng phân tử là 30 kDa:
Thịt tươi
Cắt miếng
Không chitosan Chitosan 1% Chitosan-glucose (ĐC1) (ĐC2)
CT1 CT2 CT3 Thí nghiệm thực hiện tương tự với chitosan-glucose có khối lượng phân tử 300 kDa và 700 kDa.
- Đối với chitosan-glucosamine có khối lượng phân tử là 30 kDa:
Thịt tươi
Cắt miếng
Không chitosan Chitosan 1% Chitosan-glucosamine (ĐC1) (ĐC2)
CT1 CT2 CT3
Tương tự với chitosan-glucosamine có khối lượng phân tử 300 kDa và 700 kDa.
Cơ sở cho ñiểm thịt bò theo tiêu chuẩn Việt Nam 3215-79 (TCVN 3215-79):Sản phẩm thực phẩm – Phân tích cảm quan – Phương pháp cho ñiểm.
Phương pháp này sử dụng hệ thống thang ñiểm 20 gồm 6 bậc từ 0 ñến 5, ñiểm cao nhất cho một chỉ tiêu là 5 và thấp nhất là 0. Sáu bậc ñánh giá tương ứng với nội dung mô tả cụ thể như sau:
Bảng 2.1: Cơ sở cho ñiểm thịt bò theo TCVN 3215-79 Bậc ñánh giá Điểm chưa có trọng lượng
Màu sắc Mùi Trạng thái
1 5
Màu ñỏ hồng tươi ñặc trưng của thịt, mặt cắt có màu ñỏ tươi và ẩm
ướt
Mùi thơm ñặc trưng của thịt tươi, không có mùi lạ lẫn vào Cơ thịt săn chắc, ấn lõm phục hồi ngay 2 4 Màu hồng nhạt, mặt cắt có màu ñỏ hồng và ẩm ướt
Mùi thơm của thịt tươi, không có mùi
lạ lẫn vào Cơ thịt săn chắc, ấn lõm phục hồi nhanh 3 3 Màu hồng nhạt, mặt cắt có màu hồng và ẩm ướt
Mùi thơm của thịt không hể hiện rõ ràng Cơ thịt còn săn chắc, ấn lõm phục hồi hơi chậm 4 2 Màu hồng rất nhạt, cho phép một số chỗ
màu xanh lơ hoặc xám.
Mùi thơm của thịt không còn, các mùi lạ ñã xuất hiện, nhưng ở mức ñộ nhẹ Cơ thịt mềm, ấn lõm phục hồi chậm 5 1
Màu hồng tái xen lẫn với màu tái, bề mặt
hơi nhớt
Mùi ôi thiu thể hiện rất rõ Cơ thịt mềm, ấn lõm hầu như không phục hồi 6 0 Thịt có màu xanh xám, bề mặt rất nhớt
Mùi ôi thiu rất khó chịu, có thể gây sốc
Cơ thịt mềm nhũn, ấn lõm không phục hồi
Bảng 2.2: Hệ số quan trọng của các chỉ tiêu cảm quan của thịt
Chỉ tiêu cảm quan Hệ số quan trọng (K)
Màu sắc Mùi Trạng thái 1,7 1,3 1,0
Tích giữa ñiểm trung bình của chỉ tiêu với hệ số quan trọng của chỉ tiêu ñược gọi là ñiểm có trọng lượng của chỉ tiêu ñó. Tổng ñiểm có trọng lượng của tất cả các chỉ tiêu gọi là ñiểm chung của sản phẩm. Điểm chung của sản phẩm dùng ñể phân loại hay xếp hạng chất lượng cảm quan của sản phẩm. Để phân cấp chất lượng người ta sử dụng ñiểm có trọng lượng. Tiêu chuẩn
TCVN 3215-79 qui ñịnh các cấp chất lượng ñối với sản phẩm thực phẩm có ñiểm chung và các ñiểm trung bình chưa có trọng lượng ñối với một chỉ tiêu, ñược thể hiện ở bảng sau:
Bảng 2.3: Bảng phân cấp chất lượng thịt
Cấp chất lượng Điểm chung
Yêu cầu về ñiểm trung bình chưa có trọng lượng ñối với các chỉ tiêu
Loại tốt 18,6 ÷ 20,0 Các chỉ tiêu quan trọng nhất≥4,7 Loại khá 15,2 ÷ 18,2 Các chỉ tiêu quan trọng nhất≥3,8 Loại trung bình 11,2 ÷ 15,1 Các chỉ tiêu quan trọng nhất≥2,8 Loại kém (không ñạt chất
lượng trong tiêu chuẩn nhưng vẫn bán ñược)
7,2 ÷ 11,2 Các chỉ tiêu quan trọng nhất≥1,8 Loại rất kém (không có khả
năng bán ñược nhưng khi tái chế còn có thể dùng
ñược)
4,0 ÷ 7,1 Các chỉ tiêu quan trọng nhất≥1,0 Loại hỏng (không sử dụng
ñược) 0,0 ÷ 3,9 Các chỉ tiêu quan trọng nhất≥0,0
2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu
- Tất cả các thí nghiệm ñược thực hiện với 3 lần lặp lại và xử lý thống kê bằng phần mềm MS-STAT.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu chế tạo dẫn suất chitosan cải biến
Chitosan có hoạt tính kháng khuẩn khá mạnh nhờ tính chất polycation
của các nhóm NH2. Tính chất polycation của chitosan giúp cho chitosan gắn
chặt với màng polyanion của tế bào vi khuẩn làm rối loạn quá trình trao ñổi chất qua màng và dẫn ñến tế tào vi khuẩn bị chết. Tuy nhiên một số vi khuẩn có hoạt tính enzyme chitosanase, cellulase ngoại bào có khả năng phân hủy mạch chitosan làm mất hoạt tính của chế phẩm này. Mục tiêu của nội dung này là gắn các gốc ñường như glucosamine, glucose vào mạch nhánh của chitosan (chitosan cải biến) ñể làm thay ñổi cấu trúc của chitosan giúp hạn chế khả năng phân hủy của hệ enzyme vi khuẩn.
3.1.1. Ảnh hưởng khối lượng phân tử của chitosan và tỷ lệ nồng ñộ chitosan/glucose ñến phản ứng Maillard chitosan/glucose ñến phản ứng Maillard
Phản ứng Maillard là phản ứng giữa nhóm amin (-NH2) của chitosan với nhóm (-CHO) của ñường glucose. Dẫn suất tạo thành có màu vàng hấp thu ở bước sóng 420nm, mức ñộ gắn tỷ lệ thuận với ñộ hấp thụ (OD) ở 420nm.
Chitosan sử dụng trong thí nghiệm có khối lượng phân tử khác nhau
(30 kDa, 300 kDa, 700 kDa) phản ứng với ñường glucose ở nhiệt ñộ 1210C
trong vòng 15 phút, sau ñó ñể nguội rồi ñem ño OD ở bước sóng 420nm ñể xác ñịnh mức ñộ gắn.
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử và nồng ñộ ñường glucose ñến mức ñộ phản ứng Maillard
Nghiệm thức Khối lượng phân tử Tỷ lệ chitosan/glucose OD420 1 30 kDa 1:1 0,299 b 2 2:1 0,360ab 3 5:1 0,357ab 4 300 kDa 1:1 0,404ab 5 2:1 0,450a 6 5:1 0,384ab 7 700 kDa 1:1 0,404ab 8 2:1 0,480a 9 5:1 0,440a ANOVAz Khối lượng Công thức
Khối lượng x công thức CV (%) ** ** ** 4,21 z **: khác biệt rất có ý nghĩa ở mức P ≤ 0,01
Kết quả bảng 3.1 cho thấy chitosan có khối lượng phân tử khác nhau thì khả năng gắn ñường khác nhau. Khối lượng phân tử của chitosan càng lớn thì khả năng gắn ñường glucose càng lớn. Chitosan khối lượng phân tử 30kDa, tỷ lệ chitosan/glucose 2:1 có OD420 là 0,360 tăng lên 0,450 ở chitosan 300kDa và 0.480 ở chitosan 700 kDa. Điều này chứng tỏ mạch chitosan càng dài, số
lượng nhóm NH2 trong mạch càng lớn thì khả năng gắn với nhóm –CHO của
ñường glucose càng lớn. Sự khác biệt khả năng gắn glucose giữa các chitosan có khối lượng phân tử khác nhau là có ý nghĩa thống kê với mức P ≤ 0,01.
So sánh về ảnh hưởng của tỷ lệ nồng ñộ chitosan/ glucose ñến mức ñộ phản ứng Maillard cho thấy ở cả ba khối lượng phân tử tỷ lệ chitosan/glucose thích hợp là 2:1. Tỷ lệ ñường cao chitosan/glucose 1:1 hoặc nồng ñộ ñường quá thấp chitosan/glucose 5:1 thì phản ứng Maillard diễn ra ở mức ñộ thấp
hơn (bảng 3.1). Ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan/glucose là có ý nghĩa thống kê với xác suất P≤0,01. Tương quan giũa khối lượng phân tử chitosan và tỷ lệ nồng ñộ chitosan/glucose là có ý nghĩa thống kê.
3.1.2. Ảnh hưởng khối lượng phân tử của chitosan và nồng ñộ ñường glucose ñến phản ứng Maillard gắn glucosamine vào mạch chitosan ñến phản ứng Maillard gắn glucosamine vào mạch chitosan
Cải biến dẫn suất chitosan – glucosamine ñược thực hiện bằng phản ứng của Maillard. Chitosan có khối lượng phân tử khác nhau (30 kDa, 300 kDa, 700 kDa) hỗn hợp với glucosamine ở các nồng ñộ khác nhau tương tự
như thí nghiệm với glucose và thực hiện phản ứng Maillard ở nhiệt ñộ 1210C
trong vòng 20 phút, sau ñó ñể nguội rồi ñem ño OD ở bước sóng 420nm.
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử và nồng ñộ ñường glucosamine ñến mức ñộ phản ứng Maillard