M Ở ðẦ U
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu tài liệu
Thu thập, nghiên cứu và phân tích, kế thừa các tài liệu ñã có trên thế giới và Việt Nam về phương pháp phân hủy xác ñịnh ñồng, chì và cadimi trong mẫu huyết thanh.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích ñồng, chì và cadimi trong huyết thanh trên thiết bị ICP-MS
Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình xác ñịnh ñồng thời ñồng, chì, cadimi trong huyết thanh bằng phương pháp ICP-MS bao gồm 2 phần chính sau: quy trình phân hủy mẫu huyết thanh và quy trình phân tích mẫu trên thiết bị ICP-MS.
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng các thuật toán ñể tính toán kết quả phân tích.
2.3. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
2.3.1. Hóa chất
Tất cả hóa chất dùng trong nghiên cứu như HNO3, H3PO4, HCl, H2SO4, HF, Triton X-100 ñều là các hóa chất siêu sạch (Merck).
Dung dịch chuẩn của các kim loại Cu, Pb, Cd ñều là các hóa chất siêu sạch ñược mua từ hãng Merck có nồng ñộ gốc 1000ppm. Từ nồng ñộ gốc, pha chế thành các dung dịch có nồng ñộ nhỏ hơn. Các dung dịch chuẩn ñược bảo quản trong tủ lạnh. Dung dịch chuẩn ñược pha chế hàng ngày.
Các dung dịch chuẩn máy (Mg; Rh; Ce; Pb; U; In; Be; Co) nồng ñộ 10ppb ñược mua từ hãng Perkin Elmer, Mỹ.
Nước cất dùng cho nghiên cứu và phân tích là nước cất siêu sạch ñược cung cấp từ thiết bị Milipore có ñộ dẫn ñiện nhỏ hơn 18,2Ω/cm (250C). Khí Argon siêu sạch chất lượng 99,999% ñược mua từ hãng Messer.
Mẫu huyết thanh dùng trong thí nghiệm nghiên cứu thuộc nhóm máu O ñược tách li tâm trước khi mang về phòng thí nghiệm và ñược bảo quản ñông lạnh. Huyết thanh chuẩn của hãng Bio-ral, Mỹ (Assayed Chemistry Control) dạng bột khô, ñược bảo quản trong lọ nhỏ màu nâu ở nhiệt ñộ 20C dùng ñể kiểm tra mẫu, tính sai số và ñộ lặp.
2.3.2. Dụng cụ
Dụng cụ dùng trong nghiên cứu bao gồm
- Ống phá mẫu trong lò vi sóng làm bằng Teflon. - Túp nhựa của hãng Sarstedt loại 15mL và 50mL. - Các loại pipet 100µL, 1000µL và 5mL.
Vì hàm lượng các nguyên tố trong huyết thanh là vết và siêu vết nên dụng cụ dùng trong thí nghiệm phải ñược tráng rửa sạch bằng cách ngâm trong axit HNO3 (10%) từ 1-2 ngày. Sau ñó siêu âm trong 20 phút, tráng rửa lại bằng nước cất 3 lần, rồi sấy ở nhiệt ñộ 800C.
Cân phân tích của hãng Adam (Anh), có ñộ chính xác 0,0001mg dùng ñể cân mẫu chuẩn.
2.3.3.Thiết bị phân hủy mẫu và phân tích mẫu
2.3.3.1. Thiết bị phân hủy mẫu
Hệ phân hủy mẫu bằng lò vi sóng Berghof, Speed wave-4 (ðức) (hình 1), có chương trình ñiều khiển nhiệt ñộ bên trong, bên ngoài lò, áp suất và thời gian gia nhiệt.
Lò vi sóng có các ống phá mẫu bằng teflon, ký hiệu là DAK-100, có thể tích 100mL. Nhiệt ñộ và áp suất lớn nhất có thể ñạt ñược ở trong ống lần lượt là 2300C và 40 bar. Khối lượng mẫu lớn nhất cho vào trong ống là 500 mg. Thể tích mẫu tối thiểu trong ống là 5 ml
Hình 1: Thiết bị lò vi sóng
Hình 2: Dụng cụ phân hủy mẫu
2.3.3.2. Thiết bị phân tích mẫu
Thiết bị ICP-MS (Perkin Elmer, ELAN 9000) (hình 2) với hệ từ trường bát cực, sử dụng nguồn năng lượng cao tần cho quá trình hóa hơi và ion hóa tất cả các nguyên tử với hiệu suất cao và ổn ñịnh. ICP-MS ghép nối hệ sol hóa mẫu giúp quá trình làm giàu mẫu và tăng khả năng phát hiện rất phù hợp với phân tích vết các kim loại.
*Cấu tạo của thiết bị ICP-MS 9000 bao gồm các bộ phận sau - Nguồn ion plasma
- Bộ quang học ion (tứ cực)
- Thiết bị ño phổ khối lượng - tứ cực
- Bộ sol hóa mẫu bằng sóng siêu âm (USN, Perkin Elmer, Mỹ) trước khi ñưa mẫu vào buồng plasma. Hệ này giúp cho quá trình làm giàu mẫu lên nhiều lần tăng khả năng phát hiện.
- Buồng chân không và hệ lọc khối (trường tứ cực và các thấu kính ñiện từ ion)
- Vùng ghép nối (Interface) - Máy tính
Ngoài ra còn có máy lạnh tuần hoàn và hệ thống quạt hút.
Hình 3: Thiết bị ICP-MS
Hình 4: Bộ phận lấy mẫu tựñộng autosampler
2.4. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu huyết thanh
Mẫu máu ñược lấy khoảng 250-300mL vào buổi sáng ở tĩnh mạch khuỷu tay, không chứa chất chống ñông hay các chất bảo quản khác. Sau khi tiệt trùng, mẫu ñược chứa trong loại túi sử dụng 1 lần của hãng Terumo. ðể tách huyết thanh, mẫu máu ñược làm ñông tự nhiên trong thời gian 30 phút, sau ñó li tâm trên thiết bị Mistral 6000 với tốc ñộ 2000 vòng/phút trong thời gian 10 phút, ở nhiệt ñộ 10-150C. Huyết thanh ñược tách ra và bảo quản ở nhiệt ñộ 2-80C.
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Các phương pháp phân hủy mẫu
*Lựa chọn môi trường phân hủy mẫu huyết thanh
Mẫu huyết thanh có thành phần nền hữu cơ phức tạp, chứa lượng protein tương ñối lớn vì vậy phương pháp xử lí mẫu này cho bất kỳ thiết bị phân tích nào cũng như thiết bị ICP-MS ñược quan tâm ñầu tiên, thông thường một axit hay hỗn hợp axit có khả năng hòa tan. Trong phân tích ICP- MS thì một số axit ảnh hưởng tới phép ño phổ, vì vậy việc sử dụng loại axit cho quá trình xử lí mẫu ñóng một vai trò quan trọng nhất ñể ñảm bảo mẫu tan hoàn toàn ở dạng ñồng nhất và không ảnh hưởng tới phép ño. Thực tế khảo sát với 1gam mẫu huyết thanh thêm và không thêm chuẩn với 2 mức 0,1µg và 10µg chuẩn ñược xử lí với 10ml axit các loại axit HNO3, HCl, H3PO4, H2SO4, hỗn hợp HNO3 và HCl, hỗn hợp HNO3 , H2SO4 và HF, thể tích ñịnh mức cuối cùng là 50 ml. Thực nghiệm cho thấy chỉ có HNO3, H3PO4 và hỗn hợp HNO3 , H2SO4 và HF hòa tan mẫu, tuy nhiên dễ dàng hơn cả là axit HNO3. Kết quả phân tích mẫu không thêm và mẫu thêm chuẩn với 2 mức khác nhau cho thấy ñộ thu hồi với mỗi nguyên tố là khác nhau tuy nhiên tất cả các kết quả ñều nằm trong khoảng cho phép từ 80 ñến 103% (kết quả bảng 2).
Bảng 2: ðộ thu hồi ñối với các loại axit xử lý mẫu khác nhau
Hiệu suất thu hồi (%)
Axit HNO3 H3PO4 HNO3&HCl HNO3, H2SO4
& HF STT nguyên Tên tố Mức hàm lượng 0,1 µg 10 µg 0,1 µg 10 µg 0,1 µg 10 µg 0,1 µg 10 µg 1 Cu 97 95 83 82 81 85 83 80 2 Pb 95 88 96 95 97 94 80 82 3 Cd 93 88 91 86 94 96 94 96
Bảng 2 cho thấy phân hủy mẫu sử dụng axit HNO3 cho ñộ thu hồi ñối với cả ba nguyên tố từ 88 ñến 97 %. Thực nghiệm quan sát cho thấy ñây cũng là axit tốt nhất ñể hòa tan mẫu. Axit H3PO4 cho ñộ thu hồi tốt nhưng quá trình
thực nghiệm cho thấy mẫu không phân huỷ hết các chất hữu cơ; hỗn hợp axit HNO3 và HCl phân huỷ mẫu tốt nhưng cho ñộ thu hồi của Cu thấp; hỗn hợp HNO3, H2SO4 và HF cho ñộ thu hồi của Pb thấp. Vì vậy, các nghiên cứu tiếp theo ñều sử dụng HNO3 cho việc phân hủy mẫu.
3.1.1.Phương pháp pha loãng bằng HNO3
Pha các dung dịch axit HNO3 có nồng ñộ lần lượt là: 0,1%; 0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; 1% ; 1,2%; 1,5% từ dung dịch HNO3 (1:1) và dung dịch chuẩn của các nguyên tố Cu, Pb, Cd có các nồng ñộ tương ứng là 50ppm; 2ppm và 0,1ppm.
Lấy 1mL mẫu huyết thanh 50µL dung dịch chuấn vào các ống nghiệm. Tiến hành ñịnh mức ñến vạch 10mL lần lượt bằng các dung dịch HNO3 với các nồng ñộ 0,1%; 0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; 1%; 1,2% và 1,5% ñối với tất cả các ống.
Mối tương quan giữa nồng ñộ HNO3 với hàm lượng trung bình của các kim loại ñồng, chì và cadimi ñược trình bày ở trong bảng 3
Bảng 3: Ảnh hưởng của môi trường HNO3 ñến quá trình xác ñịnh hàm lượng ñồng, chì và cadimi trong mẫu huyết thanh
Nồng ñộ HNO3 (%) Hàm lượng các kim loại (ppb) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,5 Mẫu trắng 26,65 27,35 30,45 27,75 38,6 26,75 28,55 27,25 Mẫu HT 619,67 621 627 625,3 638 660 657,4 652,66 Cu Mẫu HT + chuẩn (2500ppp) 2547,33 2566,7 2836,75 2740,05 2686,7 2910 2650,65 2565,84 Mẫu trắng 0,0235 0,026 0,0195 0,021 0,011 0,028 0,016 0,0135 Mẫu HT 0,025 0,03 0,026 0,03 0,028 0,046 0,034 0,031 Cd Mẫu HT + chuẩn (5ppb) 4,29 4,3 4,22 4,3 4,3315 4,853 4,3 4,001 Pb Mẫu trắng 0,067 0,0408 0,0555 0,054 0,0525 0,02 0,0508 0,0495 Mẫu HT 0,0763 0,19 0,3 0,3 0,3137 0,309 0,3358 0,3287 Mẫu HT + chuẩn (100ppb) 85,2463 84,69 84,8 83,6 84,5337 90,819 83,9358 83,3917
ðồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng ñộ các kim loại vào nồng ñộ HNO3 trong phương pháp pha loãng bằng HNO3 (hình 5).
Ảnh hưởng của HNO3 ñối với Cu 590 595 600 605 610 615 620 625 630 635 640 0 0.5 1 1.5 2 [HNO3](%) [Cu](ppb) Ảnh hưởng của HNO3 ñối với Pb 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0 0.5 1 1.5 2 [HNO3](%) [Pb](ppb) Ảnh hưởng của HNO3 ñối với Cd 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 0.012 0.014 0.016 0.018 0.020 0 0.5 1 1.5 2 [HNO3](%) [Cd](ppb) (5a) (5b) ( 5c)
Hình 5: Ảnh hưởng của HNO3ñến quá trình xác ñịnh hàm lượng ñồng (5a), chì (5b) và cadimi (5c) trong phương pháp pha loãng bằng HNO3
Từ kết quả phân tích hàm lượng ñồng, chì và cadimi trong các mẫu (hình 5) ta thấy trong phương pháp pha loãng bằng HNO3 ở các nồng ñộ khác nhau, thì với nồng ñộ HNO3 1% thu ñược hàm lượng của các nguyên tố là cao nhất và ñộ thu hồi của các nguyên tố là tốt nhất. Như vậy sử dụng HNO3 với nồng ñộ 1% là tối ưu trong phương pháp phân hủy thường mẫu huyết thanh.
3.1.2. Phương pháp pha loãng bằng hỗn hợp HNO3 (1%) và Triton X-100
Tương tự, lấy 1mL mẫu huyết thanh và 50µL dung dịch chuẩn vào các ống nghiệm, rồi ñịnh mức ñến vạch 10mL bằng HNO3 1% và Triton X- 100 có nồng ñộ lần lượt là 0,05%; 0,075%; 0,1%; 0,15%; 0,2% ñối với tất cả các ống.
Mối tương quan giữa nồng ñộ Triton X-100 và hàm lượng của ñồng, chì, cadimi trong huyết thanh ñược trình bày ở trong bảng 4.
Bảng 4: Ảnh hưởng của Triton X-100 ñến quá trình xác ñịnh hàm lượng ñồng, chì và cadimi trong huyết thanh
Nồng ñộ Triton X-100 (%) Hàm lượng các kim loại (ppb) 0,05 0,075 0,1 0,15 0,2 Mẫu trắng 13,3 17,68 23,5 27,1 27,4 Mẫu huyết thanh 1175 1185 1285 1230 1192,7 Cu
Mẫu huyết thanh + chuẩn
(2500ppb) 3195 3350 3740 3425 3246,7 Mẫu trắng 0,0771 0,0803 0,0874 0,0874 0,105 Mẫu huyết thanh 0,0868 0,0906 0,1349 0,1243 0,1411
Cd
Mẫu huyết thanh + chuẩn
(5ppb) 4,4418 4,1281 4,7079 4,1693 4,1321 Mẫu trắng 0,596 0,631 0,647 0,685 0,705 Mẫu huyết thanh 0,6953 0,7816 0,8375 0,7749 0,7924
Pb
Mẫu huyết thanh + chuẩn
(100ppb) 83,7903 84,7116 92,3175 80,9299 82,0624
Hình 6 là ñồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng ñộ các kim loại vào nồng ñộ Triton X-100 trong phương pháp pha loãng bằng hỗn hợp HNO3 và Triton X-100 Ảnh hưởng của Triton X-100 0 500 1000 1500 2000 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 [Triton X-100](%) [Cu](ppb) Ảnh hưởng của Triton X-100 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 [Triton X-100](%) [Pb](ppb) Ảnh hưởng của Triton X-100 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 [Triton X-100](%) [Cd](ppb) 6a 6b 6c
Hình 6: Ảnh hưởng của nồng ñộ Triton X-100 ñến quá trình xác ñịnh hàm lượng ñồng (6a), chì (6b) và cadimi (6c) trong phương pháp pha loãng mẫu
huyết thanh bằng hỗn hợp HNO3 và Triton X-100
Kết quả phân tích hàm lượng ñồng, chì và cadimi trong các mẫu ta thấy trong phương pháp pha loãng bằng hỗn hợp HNO3 1% và Triton X-100 thì sử dụng hỗn hợp HNO3 1% và Triton X-100 với nồng ñộ 0,1% là tối ưu vì các nguyên tố Cu, Pb và Cd ñều ñược phát hiện ở nồng ñộ cao nhất.
3.1.3. Phương pháp phân hủy bằng lò vi sóng
Các dung dịch HNO3 có nồng ñộ 0,1%; 0,5%, 1%; 1,5% và 2% ñược lựa chọn ñể khảo sát ảnh hưởng của nồng ñộ HNO3 trong phương pháp phân hủy mẫu huyết thanh bằng lò vi sóng với chương trình có sẵn trong thiết bị (bảng 5). 1 mL mẫu huyết thanh ñược pha loãng ñến 10mL lần lượt bằng các dung dịch HNO3 nồng ñộ từ 0,1% ñến 2%. Sau ñó, cho vào các ống phá Teflon ñể tiến hành phân hủy mẫu huyết thanh bằng lò vi sóng.
Bảng 5: Chương trình phá mẫu huyết thanh trong lò vi sóng
Các bước Nhiệt ñộ (0C) Áp suất (Bar) Thời gian (Phút)
1 160 50 5
2 190 50 10
3 50 0 10
4 50 0 10
5 50 0 10
Hàm lượng ñồng, chì và cadimi xác ñịnh ñược trong phương pháp lò vi sóng ứng với từng nồng ñộ HNO3 dùng ñể phân hủy mẫu ñược trình bày ở bảng 6.
Bảng 6: Ảnh hưởng của HNO3 ñến kết quả phân tích hàm lượng ñồng, cadimi và chì trong phương pháp phân hủy mẫu huyết thanh bằng lò vi sóng.
Nồng ñộ HNO3 (%) Nồng ñộ các kim loại (ppb) 0,1 0,5 1 1,5 2 Mẫu trắng 16 17,21 17,75 20,75 22,95 Mẫu huyết thanh 1003,75 1355,66 1356,2 1095 1075 Cu
Mẫu huyết thanh + chuẩn (2500ppb) 3435,5 3747,41 3788,45 3350 3555
Mẫu trắng 0,0562 0,0768 0,0797 0,0824 0,0976
Mẫu huyết thanh 0,07 0,124 0,1535 0,1179 0,1321 Cd
Mẫu huyết thanh + chuẩn (5ppb) 4,0435 3,784 4,4685 4,5014 43,1647
Mẫu trắng 0,689 0,776 0,824 0,859 0,901
Mẫu huyết thanh 0,8146 0,9239 1,1292 1,0704 1,0135 Pb
Sự phụ thuộc của nồng ñộ các kim loại vào nồng ñộ HNO3 trong phương pháp phân hủy bằng lò vi sóng ñược biểu diễn trong hình 7
Phương pháp lò vi sóng 0 500 1000 1500 2000 0 0.5 1 1.5 2 2.5 [HNO3](%) [Cu](ppb) Phương pháp lò vi sóng 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 0.5 1 1.5 2 2.5 [HNO3](%) [Pb](ppb) Phương pháp lò vi sóng 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0 0.5 1 1.5 2 2.5 [HNO3](%) [Cd](ppb) 7a 7b 7c
Hình 7: Ảnh hưởng của HNO3ñến quá trình xác ñịnh hàm lượng ñồng (7a), chì (7b) và cadimi (7c) trong phương pháp phân hủy mẫu bằng lò vi sóng
Từ kết quả phân tích hàm lượng ñồng, chì và cadimi trong các mẫu ta thấy trong phương pháp phân hủy mẫu huyết thanh bằng lò vi sóng, với nồng ñộ HNO3 1% thu ñược hàm lượng của các nguyên tố là cao nhất. Như vậy sử dụng HNO3 với nồng ñộ 1% là tối ưu trong phương pháp phân hủy bằng lò vi sóng mẫu huyết thanh.
3.1.4. So sánh các phương pháp phân hủy mẫu
So sánh các phương pháp phân hủy mẫu ñể xác ñịnh hàm lượng các nguyên tố ñồng, chì và cadimi trong mẫu huyết thanh cho thấy phương pháp phân hủy mẫu bằng lò vi sóng là tối ưu nhất cho xác ñịnh ñồng thời cả ba nguyên tố Cu, Pb và Cd (bảng 7, hình 8).
Bảng 7: Hàm lượng các nguyên tốñồng, chì, cadimi trong huyết thanh ứng với từng phương pháp phân hủy mẫu ñược khảo sát.
Nồng ñộ các nguyên tố (ppb) Các phương pháp phân hủy mẫu
Cu Cd Pb
Phương pháp pha loãng bằng HNO3 1% 633,25 0,0183 0,289 Phương pháp pha loãng bằng HNO3 1%
và Triton X-100 0,1% 1261,5 0,0475 0,1905 Phân hủy bằng lò vi sóng với HNO3 1% 1447,250 0,0738 0,3052
Hình 8: Ảnh hưởng của các phương pháp phân hủy mẫu ñến quá trình xác ñịnh hàm lượng các kim loại ñồng, chì và cadimi trong mẫu huyết thanh
Ảnh hưởng của các phương pháp phá mẫu 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 PP1 PP2 PP3 Các phương pháp [KL](ppb) Cu Cd Pb
(PP1: Phương pháp pha loãng bằng HNO3 1%; PP2: Phương pháp pha loãng bằng hỗn hợp HNO3 1% và Triton X-100 0,1% ; PP3: Phương pháp phân hủy bằng lò vi
sóng với HNO3 1%)
3.2. Khảo sát các ñiều kiện tối ưu trong quá trình phân tích mẫu trên thiết bị ICP-MS
Mẫu huyết thanh có thành phần nền tương ñối phức tạp, quá trình phân tích ñòi hỏi mẫu phải phân hủy tới dạng dung dịch ñồng nhất mà không làm mất các ñồng vị cần phân tích. Các yếu tố nền có khả năng ảnh hưởng tới việc