M Ở ðẦ U
1.3.5. Phương pháp phân hủy mẫu bằng lò vi sóng
*Nguyên tắc: Dùng năng lượng của lò vi sóng ñể ñun nóng mẫu ñược ñựng trong bình kín. Trong ñiều kiện nhiệt ñộ và áp suất cao, mẫu ñược hòa tan dễ dàng. ðây là phương pháp xử lý mẫu hiện ñại nhất hiện nay, làm giảm ñáng kể thời gian xử lý mẫu, không mất mẫu và vô cơ hóa mẫu ñược triệt ñể. Có thể vô cơ hóa cùng một lúc ñược nhiều mẫu, Tuy nhiên, phương pháp này ñòi hỏi thiết bị rất ñắt tiền mà nhiều cơ sở phân tích không ñủ ñiều kiện trang bị.
*Cơ chế của sự phân hủy mẫu trong lò vi sóng[8]
Các tác nhân phân hủy mẫu bao gồm axit [có tác dụng phá hủy và hòa tan các hạt (phân tử) mẫu], năng lượng nhiệt (có tác dụng làm tan rã các hạt mẫu cùng với axit), sự khuếch tán ñối lưu, chuyển ñộng nhiệt và va chạm của các hạt mẫu với nhau làm cho chúng bị bào mòn dần. Ngoài ra, trong lò vi sóng còn có sự phá vỡ từ trong lòng hạt mẫu ra ngoài, do các phân tử nước
hấp thụ (90%) năng lượng vi sóng và có ñộng năng rất lớn, nên chúng có chuyển ñộng nhiệt rất mạnh, làm căng và xé các hạt mẫu từ trong ra. Thêm vào ñó, vì là hệ kín nên có áp suất cao, sẽ làm cho nhiệt ñộ sôi lại cao hơn, ñây là tác nhân phân hủy mạnh nhất, do ñó thúc ñẩy quá trình phân hủy mẫu rất nhanh từ trong ra và từ ngoài vào. Vì thế nên việc xử lý mẫu trong lò vi sóng chỉ cần thời gian rất ngắn (30-70 phút) mà lại triệt ñể.
*Các quá trình xảy ra khi phân hủy mẫu bằng lò vi sóng
Dưới tác dụng của axit, năng lượng nhiệt (nhiệt ñộ) và năng lượng vi sóng các quá trình vật lý và hóa học sau ñây sẽ xảy ra:
- Sự phá vỡ mạng lưới cấu trúc của hạt mẫu, giải phóng các chất phân tích, ñể ñưa chúng vào dung dịch dưới dạng các muối tan.
- Quá trình oxi hóa khử làm thay ñổi hóa trị, chuyển ñổi dạng, làm tan vỡ các hạt mẫu, ñể giải phóng chất phân tích về dạng muối tan.
- Nếu xử lý mẫu hữu cơ phân tích kim loại, thì có sự ñốt cháy, phá hủy các hợp chất hữu cơ và mùn tạo ra khí CO2 và nước, ñể giải phóng các kim loại trong chất hữu cơ về dạng muối vô cơ tan trong dung dịch.
- Tạo hợp chất dễ bay hơi làm mất ñi các anion trong phân tử chất mẫu, làm mẫu bị phân hủy tạo ra các hợp chất tan trong dung dịch.
- Sự tạo thành các hợp chất muối hay phức tan trong dung dịch.
- Cơ chế tách chất phân tích ra khỏi mẫu ban ñầu ở dạng kết tủa không tan và nhờ ñó người ta tách ñược các chất phân tích và làm giầu chúng.
Như vậy, trong quá trình xử lý mẫu ở ñây cũng có thể có các phản ứng hóa học xảy ra như phản ứng oxy hóa khử, phản ứng thủy phân, phản ứng tạo phức, phản ứng hòa tan, phản ứng kết tủa, ….của các phân tử chất mẫu với các axit dùng ñể phân hủy mẫu và các chất có trong mẫu với nhau. Trong ñó, quá trình nào là chính, quá trình nào là phụ ñược quyết ñịnh bởi thành phần chất nền, bản chất của chất mẫu và các loại axit dùng ñể phân hủy và hòa tan mẫu.
1.4.Phương pháp xác ñịnh ñộ lặp lại và ñộ chính xác[10; 13]
ðộ lặp và ñộ chính xác là hai ñại lượng quan trọng ñể ñánh giá một phương pháp phân tích.
1.4.1. ðộ lặp lại
ðộ lặp lại là ñại lượng ñặc trưng cho mức ñộ gần nhau giữa các giá trị riêng lẻ xi của cùng một mẫu phân tích, ñược tiến hành bằng một phương pháp phân tích, trong cùng một ñiều kiện thí nghiệm (người phân tích, trang thiết bị, phòng thí nghiệm) trong khoảng thời gian ngắn.
*Các ñại lượng ñặc trưng cho ñộ lặp lại
Khoảng biến thiên R: là hiệu số giữa giá trị lớn nhất và giá trị nhỏ nhất trong một tập số liệu
R = xmax - xmin
ðộ lớn của R phụ thuộc vào kích thước mẫu. Với cùng sai số ngẫu nhiên, khi số phép ño tăng R sẽ tăng. Do ñó, khoảng biến thiên ñược dùng ñể ñặc trưng cho ñộ phân tán của tập số liệu khi phép ño nhỏ.
Phương sai (σ2 và S2): là giá trị trung bình của tổng bình phương sự sai khác giữa các giá trị riêng rẽ trong tập số liệu so với giá trị trung bình. Phương sai không cùng thứ nguyên với các ñại lượng ño.
N x x N i i ∑ = − − = 1 2 2 ) ( σ Nếu tập số liệu nhỏ thì − − = − =∑ ∑ ∑ = = = N i N i i i N i i N x x N N x x S 1 1 2 1 2 2 1 1 ) ( (với N-1=f là số bậc tự do)
Khi có m tập số liệu, mỗi tập số liệu làm k thí nghiệm lặp lại với cùng một mẫu thì
( ) k N x x S m j k i i ij − − = ∑ ∑ =1 =1 2 2 (với N là tổng tất cả các thí nghiệm N = m.k)
Nếu phương sai càng lớn thì ñộ tản mạn của các giá trị ño lặp lại càng lớn hay ñộ lặp lại càng kém.
ðộ lệch chuẩn (σf hoặc Sf): ðộ lệch chuẩn của một tập số liệu kết quả nghiên cứu ñặc trưng cho ñộ phân tán các số liệu trong tập hợp so với giá trị trung bình và ñược xác ñịnh theo phương trình
( ) N x x N i i f ∑ = − = 1 2 σ hay σf = σ2
(Với N là số thí nghiệm lặp lại của tập hợp, thực tế thường xem các tập số liệu có N>30 là tập hợp). Hoặc ( ) N x x S N i i f ∑ = − = 1 2 hay 2 S
Sf = (với N là số thí nghiệm trong mẫu thống kê ñược rút ra từ tập hợp. Số bậc tự do trong trường hợp này là f = N – 1)
ðộ lệch chuẩn tương ñối (RSD) và hệ số biến thiên (CV)
RSD là tỉ số giữa ñộ lệch chuẩn và giá trị trung bình
% 100 . (%) x S RSD = f
RSD(%) còn ñược gọi là hệ số biến thiên. ðại lượng này ñược dùng ñể ñánh giá ñộ chính xác tương ñối của phép phân tích.
1.4.2. ðộ chính xác
ðộ chính xác là ñại lượng ñặc trưng cho mức ñộ gần nhau của giá trị phân tích (thường là giá trị trung bình x) với giá trị thực hay giá trị ñã ñược chấp nhận xt hay µ.
Khi không có sai số hệ thống thì giá trị trung bình tiến tới giá trị thực nếu số phép ño rất lớn (N→∞). Vì vậy, có thể nói ñộ chính xác tùy thuộc vào số phép ño.
ðộ chính xác ñược biểu diễn dưới dạng sai số tuyệt ñối hoặc sai số tương ñối. Trong ñó sai số tuyệt ñối (EA) là sự sai khác giữa giá trị ño ñược (xi) với giá trị thật hay giá trị ñã biết trước (xt hay µ)
EA = xi - µ
Còn sai số tương ñối (ER) là tỷ số giữa sai số tuyệt ñối và giá trị thật hay giá trị ñã biết trước µ µ − = i R x E hay (%) .100% µ A R E E =
PHẦN II. THỰC NGHIỆM 2.1. ðối tượng nghiên cứu
Mẫu huyết thanh của những người khỏe mạnh, ñộ tuổi từ 20-30 có nhóm máu O, ñã ñược sàng lọc không chứa các loại virut HIV, viêm gan A (HAV), viêm gan B (HBV), viêm gan C (HCV),…
2.2.Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu tài liệu
Thu thập, nghiên cứu và phân tích, kế thừa các tài liệu ñã có trên thế giới và Việt Nam về phương pháp phân hủy xác ñịnh ñồng, chì và cadimi trong mẫu huyết thanh.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích ñồng, chì và cadimi trong huyết thanh trên thiết bị ICP-MS
Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình xác ñịnh ñồng thời ñồng, chì, cadimi trong huyết thanh bằng phương pháp ICP-MS bao gồm 2 phần chính sau: quy trình phân hủy mẫu huyết thanh và quy trình phân tích mẫu trên thiết bị ICP-MS.
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng các thuật toán ñể tính toán kết quả phân tích.
2.3. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
2.3.1. Hóa chất
Tất cả hóa chất dùng trong nghiên cứu như HNO3, H3PO4, HCl, H2SO4, HF, Triton X-100 ñều là các hóa chất siêu sạch (Merck).
Dung dịch chuẩn của các kim loại Cu, Pb, Cd ñều là các hóa chất siêu sạch ñược mua từ hãng Merck có nồng ñộ gốc 1000ppm. Từ nồng ñộ gốc, pha chế thành các dung dịch có nồng ñộ nhỏ hơn. Các dung dịch chuẩn ñược bảo quản trong tủ lạnh. Dung dịch chuẩn ñược pha chế hàng ngày.
Các dung dịch chuẩn máy (Mg; Rh; Ce; Pb; U; In; Be; Co) nồng ñộ 10ppb ñược mua từ hãng Perkin Elmer, Mỹ.
Nước cất dùng cho nghiên cứu và phân tích là nước cất siêu sạch ñược cung cấp từ thiết bị Milipore có ñộ dẫn ñiện nhỏ hơn 18,2Ω/cm (250C). Khí Argon siêu sạch chất lượng 99,999% ñược mua từ hãng Messer.
Mẫu huyết thanh dùng trong thí nghiệm nghiên cứu thuộc nhóm máu O ñược tách li tâm trước khi mang về phòng thí nghiệm và ñược bảo quản ñông lạnh. Huyết thanh chuẩn của hãng Bio-ral, Mỹ (Assayed Chemistry Control) dạng bột khô, ñược bảo quản trong lọ nhỏ màu nâu ở nhiệt ñộ 20C dùng ñể kiểm tra mẫu, tính sai số và ñộ lặp.
2.3.2. Dụng cụ
Dụng cụ dùng trong nghiên cứu bao gồm
- Ống phá mẫu trong lò vi sóng làm bằng Teflon. - Túp nhựa của hãng Sarstedt loại 15mL và 50mL. - Các loại pipet 100µL, 1000µL và 5mL.
Vì hàm lượng các nguyên tố trong huyết thanh là vết và siêu vết nên dụng cụ dùng trong thí nghiệm phải ñược tráng rửa sạch bằng cách ngâm trong axit HNO3 (10%) từ 1-2 ngày. Sau ñó siêu âm trong 20 phút, tráng rửa lại bằng nước cất 3 lần, rồi sấy ở nhiệt ñộ 800C.
Cân phân tích của hãng Adam (Anh), có ñộ chính xác 0,0001mg dùng ñể cân mẫu chuẩn.
2.3.3.Thiết bị phân hủy mẫu và phân tích mẫu
2.3.3.1. Thiết bị phân hủy mẫu
Hệ phân hủy mẫu bằng lò vi sóng Berghof, Speed wave-4 (ðức) (hình 1), có chương trình ñiều khiển nhiệt ñộ bên trong, bên ngoài lò, áp suất và thời gian gia nhiệt.
Lò vi sóng có các ống phá mẫu bằng teflon, ký hiệu là DAK-100, có thể tích 100mL. Nhiệt ñộ và áp suất lớn nhất có thể ñạt ñược ở trong ống lần lượt là 2300C và 40 bar. Khối lượng mẫu lớn nhất cho vào trong ống là 500 mg. Thể tích mẫu tối thiểu trong ống là 5 ml
Hình 1: Thiết bị lò vi sóng
Hình 2: Dụng cụ phân hủy mẫu
2.3.3.2. Thiết bị phân tích mẫu
Thiết bị ICP-MS (Perkin Elmer, ELAN 9000) (hình 2) với hệ từ trường bát cực, sử dụng nguồn năng lượng cao tần cho quá trình hóa hơi và ion hóa tất cả các nguyên tử với hiệu suất cao và ổn ñịnh. ICP-MS ghép nối hệ sol hóa mẫu giúp quá trình làm giàu mẫu và tăng khả năng phát hiện rất phù hợp với phân tích vết các kim loại.
*Cấu tạo của thiết bị ICP-MS 9000 bao gồm các bộ phận sau - Nguồn ion plasma
- Bộ quang học ion (tứ cực)
- Thiết bị ño phổ khối lượng - tứ cực
- Bộ sol hóa mẫu bằng sóng siêu âm (USN, Perkin Elmer, Mỹ) trước khi ñưa mẫu vào buồng plasma. Hệ này giúp cho quá trình làm giàu mẫu lên nhiều lần tăng khả năng phát hiện.
- Buồng chân không và hệ lọc khối (trường tứ cực và các thấu kính ñiện từ ion)
- Vùng ghép nối (Interface) - Máy tính
Ngoài ra còn có máy lạnh tuần hoàn và hệ thống quạt hút.
Hình 3: Thiết bị ICP-MS
Hình 4: Bộ phận lấy mẫu tựñộng autosampler
2.4. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu huyết thanh
Mẫu máu ñược lấy khoảng 250-300mL vào buổi sáng ở tĩnh mạch khuỷu tay, không chứa chất chống ñông hay các chất bảo quản khác. Sau khi tiệt trùng, mẫu ñược chứa trong loại túi sử dụng 1 lần của hãng Terumo. ðể tách huyết thanh, mẫu máu ñược làm ñông tự nhiên trong thời gian 30 phút, sau ñó li tâm trên thiết bị Mistral 6000 với tốc ñộ 2000 vòng/phút trong thời gian 10 phút, ở nhiệt ñộ 10-150C. Huyết thanh ñược tách ra và bảo quản ở nhiệt ñộ 2-80C.
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Các phương pháp phân hủy mẫu
*Lựa chọn môi trường phân hủy mẫu huyết thanh
Mẫu huyết thanh có thành phần nền hữu cơ phức tạp, chứa lượng protein tương ñối lớn vì vậy phương pháp xử lí mẫu này cho bất kỳ thiết bị phân tích nào cũng như thiết bị ICP-MS ñược quan tâm ñầu tiên, thông thường một axit hay hỗn hợp axit có khả năng hòa tan. Trong phân tích ICP- MS thì một số axit ảnh hưởng tới phép ño phổ, vì vậy việc sử dụng loại axit cho quá trình xử lí mẫu ñóng một vai trò quan trọng nhất ñể ñảm bảo mẫu tan hoàn toàn ở dạng ñồng nhất và không ảnh hưởng tới phép ño. Thực tế khảo sát với 1gam mẫu huyết thanh thêm và không thêm chuẩn với 2 mức 0,1µg và 10µg chuẩn ñược xử lí với 10ml axit các loại axit HNO3, HCl, H3PO4, H2SO4, hỗn hợp HNO3 và HCl, hỗn hợp HNO3 , H2SO4 và HF, thể tích ñịnh mức cuối cùng là 50 ml. Thực nghiệm cho thấy chỉ có HNO3, H3PO4 và hỗn hợp HNO3 , H2SO4 và HF hòa tan mẫu, tuy nhiên dễ dàng hơn cả là axit HNO3. Kết quả phân tích mẫu không thêm và mẫu thêm chuẩn với 2 mức khác nhau cho thấy ñộ thu hồi với mỗi nguyên tố là khác nhau tuy nhiên tất cả các kết quả ñều nằm trong khoảng cho phép từ 80 ñến 103% (kết quả bảng 2).
Bảng 2: ðộ thu hồi ñối với các loại axit xử lý mẫu khác nhau
Hiệu suất thu hồi (%)
Axit HNO3 H3PO4 HNO3&HCl HNO3, H2SO4
& HF STT nguyên Tên tố Mức hàm lượng 0,1 µg 10 µg 0,1 µg 10 µg 0,1 µg 10 µg 0,1 µg 10 µg 1 Cu 97 95 83 82 81 85 83 80 2 Pb 95 88 96 95 97 94 80 82 3 Cd 93 88 91 86 94 96 94 96
Bảng 2 cho thấy phân hủy mẫu sử dụng axit HNO3 cho ñộ thu hồi ñối với cả ba nguyên tố từ 88 ñến 97 %. Thực nghiệm quan sát cho thấy ñây cũng là axit tốt nhất ñể hòa tan mẫu. Axit H3PO4 cho ñộ thu hồi tốt nhưng quá trình
thực nghiệm cho thấy mẫu không phân huỷ hết các chất hữu cơ; hỗn hợp axit HNO3 và HCl phân huỷ mẫu tốt nhưng cho ñộ thu hồi của Cu thấp; hỗn hợp HNO3, H2SO4 và HF cho ñộ thu hồi của Pb thấp. Vì vậy, các nghiên cứu tiếp theo ñều sử dụng HNO3 cho việc phân hủy mẫu.
3.1.1.Phương pháp pha loãng bằng HNO3
Pha các dung dịch axit HNO3 có nồng ñộ lần lượt là: 0,1%; 0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; 1% ; 1,2%; 1,5% từ dung dịch HNO3 (1:1) và dung dịch chuẩn của các nguyên tố Cu, Pb, Cd có các nồng ñộ tương ứng là 50ppm; 2ppm và 0,1ppm.
Lấy 1mL mẫu huyết thanh 50µL dung dịch chuấn vào các ống nghiệm. Tiến hành ñịnh mức ñến vạch 10mL lần lượt bằng các dung dịch HNO3 với các nồng ñộ 0,1%; 0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; 1%; 1,2% và 1,5% ñối với tất cả các ống.
Mối tương quan giữa nồng ñộ HNO3 với hàm lượng trung bình của các kim loại ñồng, chì và cadimi ñược trình bày ở trong bảng 3
Bảng 3: Ảnh hưởng của môi trường HNO3 ñến quá trình xác ñịnh hàm lượng ñồng, chì và cadimi trong mẫu huyết thanh
Nồng ñộ HNO3 (%) Hàm lượng các kim loại (ppb) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,5 Mẫu trắng 26,65 27,35 30,45 27,75 38,6 26,75 28,55 27,25 Mẫu HT 619,67 621 627 625,3 638 660 657,4 652,66 Cu Mẫu HT + chuẩn (2500ppp) 2547,33 2566,7 2836,75 2740,05 2686,7 2910 2650,65 2565,84 Mẫu trắng 0,0235 0,026 0,0195 0,021 0,011 0,028 0,016 0,0135 Mẫu HT 0,025 0,03 0,026 0,03 0,028 0,046 0,034 0,031 Cd Mẫu HT + chuẩn (5ppb) 4,29 4,3 4,22 4,3 4,3315 4,853 4,3 4,001 Pb Mẫu trắng 0,067 0,0408 0,0555 0,054 0,0525 0,02 0,0508 0,0495 Mẫu HT 0,0763 0,19 0,3 0,3 0,3137 0,309 0,3358 0,3287