M Ở ðẦ U
1.3. Các phương pháp xử lý mẫu
Xử lý mẫu phân tích là một quá trình phức tạp, có hóa học, có vật lý, hay vật lý và hóa học kết hợp, ñể phân hủy mẫu chuyển các chất, hay các nguyên tố, hay các ion cần xác ñịnh có trong mẫu phân tích ban ñầu về dạng tan trong một dung môi thích hợp như nước hay dung môi hữu cơ,…ñể sau ñó
có thể xác ñịnh ñược nó theo một phương pháp thích hợp. Tuy nhiên việc xử lý mẫu phân tích lại ñược thực hiên theo rất nhiều kỹ thuật có nguyên lý, cơ chế vật lý và hóa học có khi rất khác nhau, tùy theo mỗi loại mẫu và yêu cầu của phương pháp phân tích.
Các phương pháp xử lý mẫu ñã và ñang ñược sử dụng bao gồm 1.3.1. Phương pháp vô cơ hóa
1.3.1.1. Phương pháp vô cơ hóa ướt
*Xử lý bằng axit mạnh ñặc nóng
Dùng axit mạnh ñặc và nóng (ví dụ HCl, H2SO4), hay axit mạnh, ñặc và nóng có tính oxi hóa mạnh (HNO3, HClO4), hoặc hỗn hợp 2 axit (HNO3 + H2SO4), hay 3 axit (HNO3 + H2SO4 + HClO4), hoặc là 1 axit ñặc và 1 oxy hóa mạnh (H2SO4 + KMnO4)…ñể phân hủy mẫu trong ñiều kiện ñun nóng trong bình Kendan, trong ống nghiệm, trong cốc hay lò vi sóng.
Lượng axit cần dùng ñể phân hủy mẫu thường gấp 10-15 lần lượng mẫu, tùy thuộc mỗi loai mẫu và cấu trúc vật lý, hóa học của nó.
Thời gian phân hủy mẫu trong các hệ hở, bình Kendan, ống nghiệm, cốc,..thường từ vài giờ ñến hàng chục giờ tùy loại mẫu và bản chất của các chất, còn nếu trong lò vi sóng thì chỉ cần 50-90 phút.
Ưu - nhược ñiểm
Hầu như không bị mất các chất phân tích, nhất là trong lò vi sóng. Nhưng thời gian phân hủy mẫu rất dài, trong ñiều kiện thường, tốn nhiều axit ñặc tinh khiết cao, nhất là trong các hệ hở. Dễ bị nhiễm bẩn khi xử lý trong hệ hở, do môi trường hay axit dùng và phải ñuổi axit dư lâu, nên dễ bị nhiễm bẩn, bụi vào mẫu
*Xử lý bằng dung dịch kiềm mạnh ñặc nóng
Dùng dung dịch kiềm mạnh ñặc nóng (NaOH, KOH 15-20%), hay hỗn hợp của kiềm mạnh và muối kim loại kiềm (NaOH + NaHCO3), hay một kiềm mạnh và peroxit (KOH + Na2O2) nồng ñộ lớn (10-20%), ñể phân hủy mẫu phân tích trong ñiều kiện ñun nóng trong bình Kendan hay trong hộp kín, hoặc trong lò vi sóng.
Lượng dung dịch phân hủy: cần lượng lớn từ 8-15 lần lượng mẫu. Thời gian phân hủy mẫu: từ 4-10 giờ trong hệ hở. Còn trong trong hệ lò vi sóng kín chỉ cần thời gian 1-2 giờ.
Nhiệt ñộ phân hủy là nhiệt ñộ sôi của dung dịch kiềm. Nó thường nằm trong khoảng 150-200oC.
Ưu - nhược ñiểm
Ưu ñiểm là hầu như không làm mất chất phân tích, nhất là các nguyên tố có hợp chất dễ bay hơi và các nền của mẫu dễ tan trong kiềm
Nhược ñiểm là tốn rất nhiều kiềm tinh khiết cao, khả năng gây nhiễm bẩn dễ xảy ra, loại kiềm dư rất khó khăn và mất nhiều thì giờ.
1.3.1.2. Phương pháp vô cơ hóa khô
Kỹ thuật xử lý khô (tro hóa khô) là kỹ thuật nung ñể xử lý mẫu trong lò nung ở một nhiệt ñộ thích hợp (450-750oC), song thực chất ñây chỉ là bước ñầu tiên của quá trình xử lý mẫu. Vì sau khi nung, mẫu bã còn lại phải ñược hòa tan (xử lý tiếp) bằng dung dịch muối hay dung dịch axit phù hợp, thì mới chuyển các chất cần phân tích trong tro mẫu vào dung dịch ñể sau ñó xác ñịnh nó theo một phương pháp ñã chọn. Khi nung, các chất hữu cơ của mẫu sễ bị ñốt cháy thành CO2 và nước. Thời gian nung có thể từ 5-12 giờ tùy thuộc vào mỗi loại chất phân tích, cấu trúc, dạng liên kết của các chất trong mẫu.
*Ưu - nhược ñiểm
Thao tác và cách làm ñơn giản, không phải dùng nhiều axit ñặc tinh khiết cao ñắt tiền, xử lý ñược triệt ñể nhất là các mẫu nền hữu cơ, ñốt cháy hết các chất hữu cơ, vì thế làm dung dịch mẫu thu ñược sạch
Nhưng có nhược ñiểm là có thể mất một số chất dễ bay hơi, ví dụ như: Cd, Pb, Zn, Sn, Sb,….nếu không có chất phụ gia và chất bảo vệ.
1.3.1.3. Phương pháp vô cơ hóa khô-ướt kết hợp
Nguyên tắc của kỹ thuật này là mẫu ñược phân hủy trong chén hay cốc nung. Trước tiên người ta xử lý ướt sơ bộ bằng một lượng nhỏ axit và chất phụ gia, ñể phá vỡ cấu trúc ban ñầu của các hợp chất mẫu và tạo ñiều kiện giữ
một số nguyên tố có thể bay hơi khi nung. Sau ñó nung ở nhiệt ñộ thích hợp. Vì thế lượng axit dùng ñể xử lý thường chỉ bằng 1/4 hay 1/5 lượng cần dùng cho xử lý ướt. Sau ñó nung sẽ nhanh hơn và quá trình xử lý sẽ triệt ñể hơn xử lý ướt, ñồng thời hạn chế ñược sự mất của một số kim loại khi nung. Do ñó ñã tận dụng ñược ưu ñiểm của cả hai kỹ thuật xủ lý ướt và khô, nhất là giảm bớt ñược các loại hóa chất (axit, kiềm tinh khiết cao) khi xử lý ướt, sau ñó hòa tan tro mẫu sẽ thu ñược mẫu trong, vì không còn chất hữu cơ và sạch hơn tro hóa ướt thông thường.
*Ưu và nhược ñiểm
Hạn chế ñược sự mất của một số chất phân tích dễ bay hơi. Sự tro hóa triệt ñể, sau khi hòa tan tro còn lại có dung dịch mẫu trong. Không phải dùng nhiều axit tinh khiết cao tốn kém, thời gian xử lý nhanh hơn tro hóa ướt. Không phải ñuổi axit dư, nên hạn chế ñược sự nhiễm bẩn. Do ñó phù hợp cho nhiều loại mẫu khác nhau ñể xác ñịnh kim loại.
1.3.2. Phương pháp chiết
Chiết là phương pháp dựa trên cơ sở sự phân bố (hay hòa tan) khác nhau của chất phân tích vào trong hai pha (hai dung môi) không trộn lẫn vào nhau. Nhờ ñó mà chúng ta lấy ñược chất cần phân tích ra khỏi pha mẫu ban ñầu, chuyển nó vào pha thứ hai (dung môi) mà chúng ta mong muốn.
Các kiểu chiết trong xử lý mẫu phân tích: - Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng
- Kỹ thuật chiết pha rắn
- Kỹ thuật chiết hấp phụ pha khí (rắn – khí) - Kỹ thuật vi chiết pha rắn (SPME)
- Kỹ thuật chiết Soxhlet - Kỹ thuật chiết siêu âm
1.3.3. Phương pháp pha loãng mẫu bằng dung môi thích hợp
Nguyên tắc ở ñây là chọn dung môi thích hợp hòa tan tốt chất mẫu, ñể pha loãng chất mẫu trong một tỷ lệ nhất ñịnh, ví dụ từ 50-500 lần. Sau ñó xác
ñịnh chất phân tích theo phương pháp ñã chọn. Kỹ thuật này ñơn giản, hầu như không cần trang bị gì hết, lại dễ thực hiện và nhanh. Nhưng nó chỉ thích hợp cho một số trường hợp chất phân tích có nồng ñộ tương ñối lớn, mà khi pha loãng mẫu nhiều lần bằng dung môi thích hợp, chúng ta vẫn xác ñịnh nó tốt trong các ñiều kiện cho phép, và các chất khác có mặt trong mẫu, khi pha loãng trong một tỷ lệ nhất ñịnh thì không cản trở và không ảnh hưởng ñến kết quả xác ñịnh chất phân tích. ðồng thời pha loãng chúng ta có thể loại bỏ ñược các cặn không tan có trong mẫu, nhất là các mẫu dầu hay chất hữu cơ.
1.3.4 Phương pháp ñiện phân
Trong bình ñiện phân, tại thế một chiều, các ion kim loại chạy về ñiện cực âm, bị ñiện phân (nhận electron của ñiện cực) trở thành các phân tử trung hòa (các nguyên tử) và bám vào ñiện cực. Do ñó ta ñược chất phân tích bám tên ñiện cực âm. Sau ñó ta có thể xác ñịnh chất trên ñiện cực bằng phương pháp khối lượng hay hòa tan chất trên ñiện cực rồi xác ñịnh nó theo một cách phù hợp. ðây là cách làm giầu chất phân tích của phương pháp phân tích cực phổ có tên là phương pháp Von–Ampe.
1.3.5. Phương pháp phân hủy mẫu bằng lò vi sóng
*Nguyên tắc: Dùng năng lượng của lò vi sóng ñể ñun nóng mẫu ñược ñựng trong bình kín. Trong ñiều kiện nhiệt ñộ và áp suất cao, mẫu ñược hòa tan dễ dàng. ðây là phương pháp xử lý mẫu hiện ñại nhất hiện nay, làm giảm ñáng kể thời gian xử lý mẫu, không mất mẫu và vô cơ hóa mẫu ñược triệt ñể. Có thể vô cơ hóa cùng một lúc ñược nhiều mẫu, Tuy nhiên, phương pháp này ñòi hỏi thiết bị rất ñắt tiền mà nhiều cơ sở phân tích không ñủ ñiều kiện trang bị.
*Cơ chế của sự phân hủy mẫu trong lò vi sóng[8]
Các tác nhân phân hủy mẫu bao gồm axit [có tác dụng phá hủy và hòa tan các hạt (phân tử) mẫu], năng lượng nhiệt (có tác dụng làm tan rã các hạt mẫu cùng với axit), sự khuếch tán ñối lưu, chuyển ñộng nhiệt và va chạm của các hạt mẫu với nhau làm cho chúng bị bào mòn dần. Ngoài ra, trong lò vi sóng còn có sự phá vỡ từ trong lòng hạt mẫu ra ngoài, do các phân tử nước
hấp thụ (90%) năng lượng vi sóng và có ñộng năng rất lớn, nên chúng có chuyển ñộng nhiệt rất mạnh, làm căng và xé các hạt mẫu từ trong ra. Thêm vào ñó, vì là hệ kín nên có áp suất cao, sẽ làm cho nhiệt ñộ sôi lại cao hơn, ñây là tác nhân phân hủy mạnh nhất, do ñó thúc ñẩy quá trình phân hủy mẫu rất nhanh từ trong ra và từ ngoài vào. Vì thế nên việc xử lý mẫu trong lò vi sóng chỉ cần thời gian rất ngắn (30-70 phút) mà lại triệt ñể.
*Các quá trình xảy ra khi phân hủy mẫu bằng lò vi sóng
Dưới tác dụng của axit, năng lượng nhiệt (nhiệt ñộ) và năng lượng vi sóng các quá trình vật lý và hóa học sau ñây sẽ xảy ra:
- Sự phá vỡ mạng lưới cấu trúc của hạt mẫu, giải phóng các chất phân tích, ñể ñưa chúng vào dung dịch dưới dạng các muối tan.
- Quá trình oxi hóa khử làm thay ñổi hóa trị, chuyển ñổi dạng, làm tan vỡ các hạt mẫu, ñể giải phóng chất phân tích về dạng muối tan.
- Nếu xử lý mẫu hữu cơ phân tích kim loại, thì có sự ñốt cháy, phá hủy các hợp chất hữu cơ và mùn tạo ra khí CO2 và nước, ñể giải phóng các kim loại trong chất hữu cơ về dạng muối vô cơ tan trong dung dịch.
- Tạo hợp chất dễ bay hơi làm mất ñi các anion trong phân tử chất mẫu, làm mẫu bị phân hủy tạo ra các hợp chất tan trong dung dịch.
- Sự tạo thành các hợp chất muối hay phức tan trong dung dịch.
- Cơ chế tách chất phân tích ra khỏi mẫu ban ñầu ở dạng kết tủa không tan và nhờ ñó người ta tách ñược các chất phân tích và làm giầu chúng.
Như vậy, trong quá trình xử lý mẫu ở ñây cũng có thể có các phản ứng hóa học xảy ra như phản ứng oxy hóa khử, phản ứng thủy phân, phản ứng tạo phức, phản ứng hòa tan, phản ứng kết tủa, ….của các phân tử chất mẫu với các axit dùng ñể phân hủy mẫu và các chất có trong mẫu với nhau. Trong ñó, quá trình nào là chính, quá trình nào là phụ ñược quyết ñịnh bởi thành phần chất nền, bản chất của chất mẫu và các loại axit dùng ñể phân hủy và hòa tan mẫu.
1.4.Phương pháp xác ñịnh ñộ lặp lại và ñộ chính xác[10; 13]
ðộ lặp và ñộ chính xác là hai ñại lượng quan trọng ñể ñánh giá một phương pháp phân tích.
1.4.1. ðộ lặp lại
ðộ lặp lại là ñại lượng ñặc trưng cho mức ñộ gần nhau giữa các giá trị riêng lẻ xi của cùng một mẫu phân tích, ñược tiến hành bằng một phương pháp phân tích, trong cùng một ñiều kiện thí nghiệm (người phân tích, trang thiết bị, phòng thí nghiệm) trong khoảng thời gian ngắn.
*Các ñại lượng ñặc trưng cho ñộ lặp lại
Khoảng biến thiên R: là hiệu số giữa giá trị lớn nhất và giá trị nhỏ nhất trong một tập số liệu
R = xmax - xmin
ðộ lớn của R phụ thuộc vào kích thước mẫu. Với cùng sai số ngẫu nhiên, khi số phép ño tăng R sẽ tăng. Do ñó, khoảng biến thiên ñược dùng ñể ñặc trưng cho ñộ phân tán của tập số liệu khi phép ño nhỏ.
Phương sai (σ2 và S2): là giá trị trung bình của tổng bình phương sự sai khác giữa các giá trị riêng rẽ trong tập số liệu so với giá trị trung bình. Phương sai không cùng thứ nguyên với các ñại lượng ño.
N x x N i i ∑ = − − = 1 2 2 ) ( σ Nếu tập số liệu nhỏ thì − − = − =∑ ∑ ∑ = = = N i N i i i N i i N x x N N x x S 1 1 2 1 2 2 1 1 ) ( (với N-1=f là số bậc tự do)
Khi có m tập số liệu, mỗi tập số liệu làm k thí nghiệm lặp lại với cùng một mẫu thì
( ) k N x x S m j k i i ij − − = ∑ ∑ =1 =1 2 2 (với N là tổng tất cả các thí nghiệm N = m.k)
Nếu phương sai càng lớn thì ñộ tản mạn của các giá trị ño lặp lại càng lớn hay ñộ lặp lại càng kém.
ðộ lệch chuẩn (σf hoặc Sf): ðộ lệch chuẩn của một tập số liệu kết quả nghiên cứu ñặc trưng cho ñộ phân tán các số liệu trong tập hợp so với giá trị trung bình và ñược xác ñịnh theo phương trình
( ) N x x N i i f ∑ = − = 1 2 σ hay σf = σ2
(Với N là số thí nghiệm lặp lại của tập hợp, thực tế thường xem các tập số liệu có N>30 là tập hợp). Hoặc ( ) N x x S N i i f ∑ = − = 1 2 hay 2 S
Sf = (với N là số thí nghiệm trong mẫu thống kê ñược rút ra từ tập hợp. Số bậc tự do trong trường hợp này là f = N – 1)
ðộ lệch chuẩn tương ñối (RSD) và hệ số biến thiên (CV)
RSD là tỉ số giữa ñộ lệch chuẩn và giá trị trung bình
% 100 . (%) x S RSD = f
RSD(%) còn ñược gọi là hệ số biến thiên. ðại lượng này ñược dùng ñể ñánh giá ñộ chính xác tương ñối của phép phân tích.
1.4.2. ðộ chính xác
ðộ chính xác là ñại lượng ñặc trưng cho mức ñộ gần nhau của giá trị phân tích (thường là giá trị trung bình x) với giá trị thực hay giá trị ñã ñược chấp nhận xt hay µ.
Khi không có sai số hệ thống thì giá trị trung bình tiến tới giá trị thực nếu số phép ño rất lớn (N→∞). Vì vậy, có thể nói ñộ chính xác tùy thuộc vào số phép ño.
ðộ chính xác ñược biểu diễn dưới dạng sai số tuyệt ñối hoặc sai số tương ñối. Trong ñó sai số tuyệt ñối (EA) là sự sai khác giữa giá trị ño ñược (xi) với giá trị thật hay giá trị ñã biết trước (xt hay µ)
EA = xi - µ
Còn sai số tương ñối (ER) là tỷ số giữa sai số tuyệt ñối và giá trị thật hay giá trị ñã biết trước µ µ − = i R x E hay (%) .100% µ A R E E =
PHẦN II. THỰC NGHIỆM 2.1. ðối tượng nghiên cứu
Mẫu huyết thanh của những người khỏe mạnh, ñộ tuổi từ 20-30 có nhóm máu O, ñã ñược sàng lọc không chứa các loại virut HIV, viêm gan A (HAV), viêm gan B (HBV), viêm gan C (HCV),…
2.2.Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu tài liệu
Thu thập, nghiên cứu và phân tích, kế thừa các tài liệu ñã có trên thế giới và Việt Nam về phương pháp phân hủy xác ñịnh ñồng, chì và cadimi trong mẫu huyết thanh.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích ñồng, chì và cadimi trong huyết thanh trên thiết bị ICP-MS
Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình xác ñịnh ñồng thời ñồng, chì, cadimi trong huyết thanh bằng phương pháp ICP-MS bao gồm 2 phần chính sau: quy trình phân hủy mẫu huyết thanh và quy trình phân tích mẫu trên thiết bị ICP-MS.
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng các thuật toán ñể tính toán kết quả phân tích.
2.3. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
2.3.1. Hóa chất
Tất cả hóa chất dùng trong nghiên cứu như HNO3, H3PO4, HCl, H2SO4, HF, Triton X-100 ñều là các hóa chất siêu sạch (Merck).
Dung dịch chuẩn của các kim loại Cu, Pb, Cd ñều là các hóa chất siêu