KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận:
nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA của chủng B8
M: Thang DNA chuẩn kích thước 1 kb B8: Sản phẩm PCR của chủng B8
Quan sát kết quả điện di chúng tôi thấy DNA tách được có độ tinh sạch cao, hàm lượng lớn, băng gọn không bị đứt gãy nhiều, đủ điều kiện cho các thí nghiệm tiếp theo, do đó chúng tôi sử dụng DNA tổng số làm khuôn, cặp mồi đặc hiệu 341F và 907R để tiến hành nhân đoạn gen 16S rRNA bằng phương pháp PCR. Sản phẩm sau khi PCR được điện di trên agarose. Kết quả điện di được thể hiện ở hình 3.7 (B). Sau khi điện di kiểm tra nhận thấy đoạn gen 16S rRNA có kích thước khoảng 550 bp và phù hợp với tính toán lý thuyết. Sản phẩm PCR này được tinh sạch và gửi đọc trình tự.
3.3.2 Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng B8
Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng B8 đã được xác định trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100. Sau khi phân tích và xử lý số liệu, chúng tôi đã thu được trình tự đoạn gen 16S rRNA được trình bày trên hình 3.8
1 tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg 61 ccgcgtgagt gatgaaggct ttcgggtcgt aaaactctgt tgttagggaa gaacaagtac 121 aagagtaacg tcttgtactt tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc 181 agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga attattgggc gtaaagcgcg 241 cgcaggcggt tttttaagtc tgttgtgaaa gcccacggct caaccgtgga gggtcattgg 301 aaactgggga acttgagtgc agaagagaaa agcggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc 361 gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcggctttt tggtctgtaa ctgacgctga 421 ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga
Hình 3.8: Trình tự đoạn gene mã hóa 16S rRNA của chủng vi khuẩn B8
Dựa vào việc so sánh trình tự đoạn gene 16S rRNA của chủng vi khuẩn B8 với trình tự các chủng vi sinh vật prokaryote chuẩn khác trên NCBI và LPSN (Lise of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature), chúng tôi đã xây dựng được cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn này (hình 3.9)
Bacillus megaterium (D16273) Bacillus flexus (AB021185)
Bacillus sp. B8
Bacillus cereus ATCC14579 (AE016877) Bacillus foraminis (AJ717382)
Bacillus fordii R-7190 (AY443039) Bacillus massiliensis (AY677116)
Bacillus subtilis (AJ276351)
Bacillus marismortui 123 (AJ009793)
Bacillus cellulosilyticus DSM 2522 (CP002394) 75 99 97 67 81 77 55 0.01
Hình 3.9: Cây phát sinh chủng loại dựa trên so sánh trình tự gen 16S rRNA của chủng B8 và các chủng vi sinh vật đại diện.
Quan sát trên hình 3.9 chúng tôi nhận thấy, chủng B8 có quan hệ gần gũi với các chủng thuộc chi Bacillus, đặc biệt có độ tương đồng tới 99% với loài Bacillus megaterium và loài Bacillus flexus. Do vậy, chủng vi khuẩn này được đặt tên là Bacillus sp. B8. Trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn này đã được đăng ký trên ngân hàng Genbank NCBI với mã số là
JQ764732 (Phụ lục).
Hiện nay, trên thế giới đã có những công bố về khả năng phân hủy diesel của chi Bacillus. Năm 2008, nghiên cứu của Singh và Lin đã phân lập được chủng Bacillus pumilus trong đất ô nhiễm dầu có khả năng phân hủy 86,94% lượng dầu DO trong 2 tuần [43]. Năm 2009, Yousefi Kebria và cộng sự đã phân lập được chủng vi khuẩn Bacillus cereus trong nước thải nhà máy
nhà máy lọc dầu ở Tehran - Iran có khả năng phân hủy 85,2% lượng dầu DO trong 15 ngày [45].
Như vậy, chủng B8 được phân lập ở trên thuộc chi Bacillus là phù hợp với nhiều nghiên cứu đã công bố.
3.4 Ảnh hưởng của một số điều kiện hóa lý trong tạo biofilm của chủng B8
Khả năng tạo biofilm của chủng vi khuẩn B8 đều chịu ảnh hưởng của điều kiện môi trường và dinh dưỡng. Để xác định các yếu tố môi trường tác động tới sự hình thành màng sinh học, phương pháp nhuộm với tím tinh thể và định lượng bằng OD570 đã được chúng tôi tiến hành.
3.4.1 Ảnh hưởng của pH
pH là yếu tố quan trọng và có ảnh hưởng rất lớn tới sự sinh trưởng và phát triển của các vi sinh vật nói chung và do đó cũng ảnh hưởng tới khả năng tạo biofilm của các chủng vi sinh vật nói riêng. Để khảo sát pH thích hợp cho sự tạo màng sinh học của chủng B8, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy chủng B8 để tạo biofilm trong điều kiện môi trường có pH là 6, 7, 8 và 9. Cứ sau 24h lượng tím kết tinh với tế bào được đo OD570 định lượng mức độ hình thành và phát triển biofilm. Kết quả được thể hiện ở hình 3.10 và 3.11
Hình 3.10: Biofilm của chủng B8 ở pH khác nhau (48h)
Hình 3.11: Ảnh hưởng của pH tới khả năng tạo biofilm của chủng B8
Kết quả ở hình 3.11 cho thấy: khả năng tạo biofilm của chủng B8 mạnh nhất trong điều kiện pH 7. Tuy nhiên tại pH 9, chủng B8 vẫn có khả năng tạo biofilm khá tốt. Điều này cũng phù hợp với nghiên cứu của Oliveira và cộng sự [38]. Kết quả này có thể giải thích hiệu quả tạo biofilm là một cơ chế giúp vi sinh vật tồn tại và phát triển trong điều kiện môi trường kém thuận lợi.
Như vậy, ở pH 7 thì khả năng tạo biofilm của chủng B8 là cao nhất, pH 7 được sử dụng tiếp cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl
Do các chủng được phân lập từ các nguồn khác nhau nên việc kiểm tra nồng độ muối có ảnh hưởng như thế nào tới sự phát triển của vi khuẩn là rất quan trọng cho việc ứng dụng về sau.
1%, 1,5%. Các chủng vi khuẩn được tiến hành nuôi để thử khả năng tạo màng ở nhiệt độ 30oC trên môi trường LB (pH 7). Kết quả của sự thay đổi nồng độ NaCl được thể hiện ở hình 3.12 và 3.13
Hình 3.12: Biofilm của chủng B8 ở nồng độ NaCl khác nhau (48h)
Hình 3.13: Ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới sự hình thành biofilm của chủng B8
Kết quả ở hình 3.13 cho thấy khả năng tạo biofilm của chủng B8 phụ thuộc rất lớn vào nồng độ muối trong môi trường. Tại các nồng độ muối 0%, 1%, 1,5% khả năng tạo biofilm không được cao. Khả năng tạo biofilm của chủng B8 đạt tối ưu tại nồng độ NaCl = 0,5%. Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Hesham [24]. Nồng độ muối 0,5% được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Các chủng vi khuẩn được tiến hành nuôi để thử khả năng tạo màng ở các nhiệt độ 4oC, 30oC, 50oC trên môi trường LB (pH 7). Kết quả được thể hiện ở hình 3.14 và 3.15
Hình 3.14: Biofilm của chủng B8 ở nhiệt độ khác nhau (48h)
Hình 3.15: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng tạo biofilm của chủng B8
Kết quả nghiên cứu cho thấy: chủng B8 có khả năng tạo biofilm tối ưu tại 30oC. Kết luận này trùng hợp với kết quả nghiên cứu của Hesham [24]. Đây cũng là điều kiện phát triển tốt của các chủng vi khuẩn khác.
Như vậy ở điều kiện pH 7, nồng độ muối 0,5%, nhiệt độ 30oC là điều kiện tối ưu cho khả năng tạo biofilm của chủng B8
Hiện nay trên thế giới, biofilm do các chủng thuộc chi Bacillus tạo ra đã được ứng dụng thành công trong công nghiệp dầu khí nhằm giảm thiểu quá trình ăn mòn kim loại trong các đường ống dẫn dầu [35]. Bên cạnh đó, các chủng vi sinh vật này thường có khả năng phân huỷ các thành phần dầu mỏ nên các biofilm đó còn được sử dụng trong xử lý nước thải ô nhiễm dầu [20]. Đặc biệt, trong một số điều kiện khắc nghiệt như: nhiệt độ cao, áp suất lớn… Năm 2001, Kato và cộng sự đã chứng minh được rằng chủng Bacillus thermoleovorans vừa có thể tạo màng sinh học vừa có thể phân hủy các alkan mạch dài, trong khi ở điều kiện nuôi lắc thì chủng này không sinh trưởng được. Do vậy, chủng này đã được ứng dụng để tạo màng sinh học nhằm xử lý ở các bể chứa xăng dầu sâu dưới lòng đất [26].
Ở Việt Nam, những công trình nghiên cứu về vi sinh vật tạo biofilm và ứng dụng của nó chưa nhiều. Năm 2011, nhóm tác giả của ĐH Quốc Gia Hà Nội đã phân lập được 4 chủng vi khuẩn là M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 từ mẫu nước thải ở các làng nghề Việt Nam. Các chủng vi khuẩn này đều thuộc chi
Bacillus và khả năng tạo biofilm của chúng tối ưu ở 30 – 37oC, pH từ 7 - 7,5 [3].
Như vậy, so sánh với các chủng vi khuẩn có khả năng tạo biofilm trên thế giới và Việt Nam, chủng B8 thuộc chi Bacillus đã chứng minh được ưu thế tạo biofilm của mình. Vì vậy, chủng B8 được xem là có tiềm năng ứng dụng trong xử lý nước thải ô nhiễm dầu ở Việt Nam.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận:
1. Từ mẫu nước thải ô nhiễm dầu chúng tôi đã phân lập được 13 chủng vi khuẩn, trong đó có 5 chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy dầu DO tốt là B4, B5, B6, B8, B13.
2. Trong số các chủng này, chủng B8 vừa có khả năng tạo biofilm cao nhất vừa phân hủy được 42% dầu DO (hàm lượng ban đầu là 3210 mg/l) sau 5 ngày nuôi cấy.
3. Chủng B8 có khuẩn lạc tròn, lồi, búng, màu trắng trong, đường kính 0,5-0,8 mm, là vi khuẩn Gram dương. Dưới kính hiển vi điện tử quét, tế bào chủng B8 có hình que ngắn, kích thước từ (0,64 – 0,86) µm x (1,14
– 1,57) µm. So sánh trình tự gen 16S rRNA cho thấy chủng B8 có độ tương đồng cao với các chủng thuộc chi Bacillus, đặc biệt có độ tương đồng tới 99% với loài Bacillus megaterium và loài Bacillus flexus. Do đó, chúng tôi đặt tên chủng này là Bacillus sp. B8. Trình tự 16S rRNA của chủng Bacillus sp. B8 được đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế với mã số là JQ764732
4. Khả năng tạo biofilm của chủng B8 tối ưu tại pH 7, nhiệt độ phù hợp là 30oC, nồng độ muối thích hợp là 0,5%
Kiến nghị:
Nghiên cứu thêm khả năng tạo biofilm đa chủng vi khuẩn và đánh giá khả năng phân hủy dầu của biofilm tạo thành đó.
PHỤ LỤC
LOCUS JQ764732 556 bp DNA linear BCT 19-MAR-2012 DEFINITION Bacillus sp. B8(2012) 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. ACCESSION JQ764732 VERSION JQ764732.1 GI:380258735 KEYWORDS . SOURCE Bacillus sp. B8 ORGANISM Bacillus sp. B8
Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus.
REFERENCE 1 (bases 1 to 556)
TITLE Direct Submission
REFERENCE 2 (bases 1 to 556)
AUTHORS Cung,M.T.N., Le,C.T.N. and Nghiem,M.N.
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (08-MAR-2012) Environmental Biotechnology, Institute of Biotechnology, 18 Hoang Quoc Viet Street, Ha Noi, Viet Nam FEATURES Location/Qualifiers source 1..556 /organism="Bacillus sp. B8(2012)" /mol_type="genomic DNA" /strain="B8"
/isolation_source="Tu Liem industrial wastewater" /db_xref="taxon:1160967"
/country="Viet Nam: Hanoi" rRNA <1..>556
/product="16S ribosomal RNA"
ORIGIN
1 tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg 61 ccgcgtgagt gatgaaggct ttcgggtcgt aaaactctgt tgttagggaa gaacaagtac 121 aagagtaacg tcttgtactt tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc 181 agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga attattgggc gtaaagcgcg 241 cgcaggcggt tttttaagtc tgttgtgaaa gcccacggct caaccgtgga gggtcattgg 301 aaactgggga acttgagtgc agaagagaaa agcggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc 361 gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcggctttt tggtctgtaa ctgacgctga 421 ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga 481 tgagtgctaa gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg cagctaacgc attaagcact 541 ccgcctgggg agtacg
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Kiều Hữu Ảnh (2006). Giáo trình vi sinh vật học, phần 1, Nxb Đại học Quốc Gia Hà Nội, tr. 81-82
2. Đinh Thúy Hằng, Lê Gia Hy, Lưu Thị Bích Thảo (1998). “Vi sinh vật phân hủy hydrocarbon dầu mỏ”, Tạp chí khoa học và công nghệ, XXXVI (3) tr. 1-12
3. Trần Thúy Hằng (2011). “Phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật phân lập ở Việt Nam”,
Luận văn thạc sỹ sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.
4. Cung Thị Ngọc Mai (2011). “Nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học các hợp chất vòng thơm của vi khuẩn phân lập từ nước thải khu công nghiệp
Từ Liêm”, Luận văn thạc sỹ sinh học - Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật - Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam
5. Cung Thị Ngọc Mai, Nguyễn Thùy Linh, Nguyễn Văn Bắc, Vũ Thị Thanh, Nghiêm Ngọc Minh (2011). “Nghiên cứu khả năng phân hủy diesel của chủng vi khuẩn BTL5 phân lập từ nước thải công nghiệp”, Tạp chí Sinh học, 33(4), tr. 86-91.
6. Tạp chí thông tin dầu khí thế giới số 7/2005
7. Bùi Xuân Thông, Nguyễn Quang Minh (2005). “Cơ sở khoa học góp phần xác định nguồn ô nhiễm dầu vùng ven bờ, cửa sông Việt Nam” Đại học Thủy Lợi
Tiếng Anh
8. Andersson S, Dalhammar G, Land CJ, Kuttuva Rajarao G (2009). “Characterization of extracellular polymeric substances from denitrifying organism Comamonas denitrificans”, Application Microbiology Biotechnology, 82(3), pp. 535-543
9. Atlas RM (1995). “Bioremediation of petroleum pollutants”, International Biodeterioration and Biodegradation, pp. 317-327
10. Bendinger B, Rijnaarts HHM, Altendorf K, Zehnder AJB (1993). “Physicochemical cell surface and adhesive properties of coryneform bacteria related to the presence and chain length of mycolic acids”,
Applied and Environmental Microbiology, 59, pp. 3973-3977
11. Burdman S, Jurkevitch E, Soria-Diaz ME, Serrano AM, Okon Y (2000). “Extracellular polysaccharide composition of Azospirillum brasilense and its relation with cell aggregation”, FEMS Microbiol Lett, 189(2), pp. 259- 264
12. Characklis WG (1990). “Biofilm processes”, Biofilms, Wiley- Interscisence, New York, pp. 195-231
13. Costerton JW, Ingram JM, Cheng KJ. (1974). “Structure and function of the cell envelope of gram-negative bacteria”, Bacteriol Rev, 38 (1), pp. 87- 110
14. Cowan MM, Warren TM, Fletcher M (1991). “Mixed species colonization of solid surfaces in laboratory biofilms”, Biofouling, 3, pp. 23-34.
15. Czaczyk KMK (2007). “Biosynthesis of Extracellular Polymeric Substances (EPS) and Its Role in Microbial Biofilm Formation”, Polish J. of Environ. Stud, 16, pp. 799-806
16. Davey ME, O’Toole GA (2000). “Microbial biofilm: from ecology to moclecular genetics”, Microbiol Mol Biol Rev, 64(4), pp. 847-867
17. Donlan RM (2002). “Biofilm: microbial life on surfaces”, Emerg Infect Dis, 8(9), pp. 881-890.
18. Donlan RM, Pipes WO, Yohe TL (1994). “Biofilm formation on cast iron substrata in water distribution systems”, Water Research, 28, pp. 1497- 1503
19. Dorobantu LS, Yeung AKC, Foght JM, Gray MR (2004). “Stabilization of Oil-Water Emulsions by hydrophobic Bacteria”, Applied and Environment Microbiology, pp. 6333-6336
20. Ebihara T, Bishop PL (2002). “Effect of acetate on biofilms utilized in PAH bioremediation”, Environmental Engineering Science 19, pp. 305- 319.
21. Fernandez – Lineares GML, Acquaviva M, Bertrand JC (1997). “Influence of glycine betaine on degradation of eicosane by Marinobacter hydrocarbonoclasticus at high salinity”, System Applied Microbiology, 20, pp. 150-153
22. Fingas FM, Charles J (2001). “The Basic of Oil Spill Cleanup”, Chapter 13: Effects of Oil Spills on the Environment, Lewis Publishers
23. Fletcher M (1988). “Attachment of Pseudomonas Fluorescens to glass and influence of electrolytes on bacterium-substratum separation distance”,
Journal of Bacteriology, 170, pp. 2027-2030.
24. Hesham ME (2008). “Biofilm Formation by Endospore-forming Bacilli on Plastic Surface under Some Food-related and Environmental stress Conditions”, Global Journal of Biotechnology & Biochemistry,3(2), pp. 69-78
25. Jessus GM, Silvia GA, Ana IA, Francisco RV (1999). “Use of 16S- 23S ribosomal gens spacer region in studies of prokaryotic diversity”, Journal Microbiol Methods, 36, pp. 55-64
26. Kato T, Haruki M, Imanaka T, Morikawa M, Kanaya S (2001). “Isolation and characterization of long-chain-alkane degrading Bacillus thermoleovornas from deep subterranean petroleum reservoirs” Journal of Bioscience and Bioengineering, 91, pp. 64-70
27. Kokare CK, Chakraborty S, Khopade AN, Mahadik KR (2009). “Biofilm Importance and applications”, Indian Journal of Biotechnology, 8, pp. 159-168
28. Lazarova V, Manem J (2000). “Innovative biofilm treatment technologies for waste and wastewater treatment”, In: Bryers JD (ed) Biofilm II: process analysis and application, Wiley-Liss, Inc, New York, pp. 159-206 29. Leahy JG, Colwel RR (1990). “Microbial degradation of hydrocarbons in
the Enviroment”, Microbiology, 182, pp. 305-315
30. Mergesin R, Schinner F (2001). “Biodegradation of hydrocarbons in extreme environment”, Applied Microbiology and Biotechnology , 56, pp. 650-663
31. Monds RD, O'Toole GA (2009). “The developmental model of microbial biofilms: ten years of a paradigm up for review”, Trends Microbiology , 17, pp. 73-87
32. Morikawa M, Kagihiro S, Haruki M, Takano K, Branda S, Kolter R, Kanaya S (2006). “Biofilm formation by a Bacillus subtilis strain that produces gamma-polyglutamate”, Microbiology, 152, pp. 2801-7
33. Mullis K, Saiki R, Scharf S, Faloona F, Horn G, Erlich H (1985). “Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia”, Science, 230, pp. 1350-1354
34. Muyzer G, Waal EC, Uitterlinden AG (1993). “Profilling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA”,