thử khả năng phân hủy dầu DO của biofilm các chủng. Kết quả được gửi đi phân tích ở Viện Hóa học công nghiệp để có kết quả cụ thể. Lượng dầu DO được xác định bằng phương pháp phân tích khối lượng theo tiêu chuẩn TCVN 4582-88. Một trăm ml (bao gồm mẫu đối chứng và mẫu chứa chủng cần đánh giá) được hòa tan trong 15 ml dung môi chloroform, sau khi hòa tan trong chloroform thì lắc nhẹ (khoảng 10 phút) cho dầu tan hoàn toàn (quá trình chiết được tiến hành 3 lần). Khi đó dầu và dung môi sẽ tách làm 2 lớp, dựng phễu chiết bỏ phần dung môi ở dưới đi. Phần dịch hòa tan còn lại được cơ bay hơi bằng bếp cách cát cho tới cạn và cân khối lượng ta sẽ được khối lượng của lượng dầu có trong 100 ml dung dịch đó.
2.2.8 Phân loại, định tên và xây dựng cây phát sinh chủng loại
Tách DNA tổng số của các chủng vi khuẩn đơn phân lập được
DNA tổng số của các chủng vi khuẩn được tách chiết và làm sạch theo mô tả của Sambrook và Russel (2001) [42]. Cụ thể là:
Bước 1: Tế bào được nuôi qua đêm trong môi trường LB lỏng sau đó thu sinh khối tế bào bằng cách li tâm với vận tốc 6000 v/p trong 10 phút.
Bước 2: Hồ tan mẫu trong dịch đệm lysis. Thành phần đệm như sau: 20 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA.
Bước 3: Bổ sung lysozim, ủ 37oC trong 15 phút
Bước 4: Bổ sung proteinase K, ủ 56oC trong 1 giờ
Bước 5: Bổ sung phenol (thể tích 1:1), li tâm 10000 v/p trong 10 phút
Bước 6: Hút dịch phía trên, bổ sung chlorofom: isoamylalcohol vào, sau đó lại tiếp tục li tâm ở vận tốc 10000 v/p trong 10 phút
Bước 7: Hút dịch phía trên, chuyển sang ống mới. Tủa DNA bằng cách thêm ethanol 100% tỉ lệ thể tích gấp 2 - 3 lần thể tích mẫu. Để lạnh – 20oC từ
3 - 4 giờ hoặc qua đêm.
Bước 8: Li tâm 14000 v/p trong 15 phút, 4oC, loại bỏ dịch thu phần cặn
Bước 9: Rửa DNA ở dạng cặn bằng ethanol 70%, li tâm ở vận tốc 14000 v/p trong 10 phút ở nhiệt độ 4oC, thu phần DNA cặn.
Bước 10: Làm khô DNA sau đó hồ tan DNA trong nước khử ion vô trùng. Nhân đoạn gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn phân lập được
Phương pháp PCR do Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Phương pháp này tạo bước nhảy vọt trong kỹ thuật sinh học phân tử và được sử dụng phổ biến đến nay [33]. Phương pháp này cho phép nhân lên số lượng lớn đoạn gen cần thiết trong thời gian ngắn. Để thực hiện được phản ứng PCR cần có các nguyên liệu chính là đoạn DNA khuôn, cặp mồi đặc hiệu, enzyme DNA polymerase, các nucleotide tự do, máy PCR.
- Cặp mồi 341F và 907R được sử dụng để nhân đoạn gene từ DNA tổng số của chủng vi khuẩn. - Thành phần phản ứng (25 µl): Buffer Taq 10x MgCl2 25mM dNTPs 2,5mM DNA khuôn 20ng/µl : 2,5 µl : 3 µl : 2,5 µl : 2 µl Mồi xuôi (20µM) Mồi ngược (20µM) Taq (5Unit/µl) dH2O : 1 µl : 1 µl : 0,5 µl : 12,5 µl - Chu trình nhiệt được sử dụng để nhân đoạn gene 16S rRNA của các
chủng vi khuẩn như sau:
Bước 1 : 95oC trong 5 phút
Bước 2 : 95oC trong 1 phút
Bước 3 : 55oC trong 1 phút
Bước 4 : 72oC trong 3 phút
Bước 5 : Lặp lại 35 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4
Bước 6 : 72oC trong 10 phút
Bước 7 : 4oC để bảo quản
Phương pháp xác định trình tự gen bằng máy tự động
trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3.100 Avant Genetic