3. VẬT LIỆ UỜ NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.3. Phát hiện nấm mốc bằng phương pháp thường quy (52 TCN-TQTP
0001:2003 và 52 TCN-TQTP 0009:2004)
3.4.3.1. Nguyên lý phương pháp
Sử dụng kỹ thuật ựổ ựĩa, ựếm khóm nấm trên môi trường thạch Sabouraud
sau khi ủ hiếu khắ ở nhiệt ựộ 28 ổ 1o C trong thời gian 5 ngày. Số lượng bào tử nấm
mốc có trong 1g(1ml) mẫu kiểm tra ựược tắnh từ số khóm nấm ựếm ựược từ các ựĩa nuôi cấy theo các ựậm ựộ pha loãng.
Sau ựó, ựể xác ựịnh tên (ựịnh danh) nấm mốc (ựến nhóm) phải tiến hành qua nhận xét ựại thể về ựặc ựiểm khuẩn lạc nấm mốc (colony characters) và nhận xét vi thể về hình thái học của khuẩn lạc nấm mốc (morphology).
3.4.3.2. Dụng cụ, môi trường và dung dịch cần thiết a. Dụng cụ, thiết bị
- Tủ cấy sinh học
- Tủ ấm 28 oC ổ 1
- Bể ựiều hoà nhiệt - Cân kĩ thuật - Nồi hấp tiệt trùng - Que cấy ựầu nhọn
- đĩa petri ựã sấy ở nhiệt ựộ Ầ - Micropipet
- Máy dập mẫu vô trùng
- Các dụng cụ chuyên dùng khác
b. Môi trường, dung dịch cần thiết
- Thạch Sabouraud - Thạch Czapeck
- Nước thạch 10/00
- Dung dịch Lactofenol Amann
c. Chuẩn bị môi trường và mẫu thử
● Chuẩn bị môi trường
Môi trường nuôi cấy, nước thạch và dung dịch cần thiết ựược ựiều chế theo công thức. Các môi trường ựược ựóng sẵn vào bình cầu, bình nón, ống nghiệm và
ựược hấp tiệt trùng (110 oC/30 phút hoặc 121 oC/15 phút).
● Pha chế môi trường * Nước thạch
- Thạch 1g
- Nước cất 1000 ml
Pha chế: đun nhỏ lửa, quấy ựều ựến khi sôi ựể hoà tan thạch. Rót vào các bình nón có dung tắch 500 ml mỗi bình 225 ml môi trường và vào các ống nghiệm
18 mỗi ống 9 ml môi trường. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt ựộ 120oC/15 phút.
Môi trường ựược bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt ựộ từ 0 ựến 5oC không quá
30 ngày. * Thạch Sabouraud Bảng 3.1: Thành phần Thạch Sabouraud Pepton 10g Glucose 20g Thạch 15-20g Nước cất 1000 ml
Pha chế: đun nhỏ lửa, quấy ựều ựến khi sôi ựể hoà tan các chất. Rót vào bình cầu có dung tắch 250 ml mỗi bình 150 ml môi trường. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở
nhiệt ựộ 110oC/30 phút.
Nếu môi trường sử dụng ngay, ựể nguội ựến 45 ổ 1oC ở nồi cách thuỷ, nếu
chưa sử dụng thì bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt ựộ từ 0 ựến 5oC không quá 30 ngày.
* Thạch Czapek Bảng 3.2: Thành phần thạch Czapek NaN0 3 3,5g K 2 HP0 4 1,5g MgS0 4 0,5g KCl 0,5g FeS0 4 0,1g đường kắnh 30g Thạch 20g Nước cất 1000ml pH = 4,5 ị 5,5
Pha chế: đun nhỏ lửa, quấy ựều ựến khi sôi ựể hoà tan các chất. để thạch
nguội ựến 45 ổ 1oC rồi chỉnh pH ựến 4,5 - 5,5. Rót vào bình cầu có dung tắch 250
ml mỗi bình 150 ml môi trường. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt ựộ 110oC/30 phút.
Thạch ựể nguội ựến 45 ổ 1oC rồi ựổ vào các hộp lồng, mỗi hộp 15 - 18 ml thạch. để
ựĩa thạch ựông tự nhiên, bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt ựộ từ 0 ựến 5oC không quá
* Dung dịch Lactofenol Amann
Bảng 3.3: Thành phần dung dịch Lactofenol Amann
Axắt fenic tinh khiết 10g
Axắt lactic 10g
Glyxerin 20g
Nước cất 10g
Pha chế: Các thành phần trên ựều cân chứ không ựong. Trộn ựều và lắc kỹ 3 chất axắt lactic, glyxerin, nước cất, rồi cho axắt fenic vào lắc ựều. Sau ựó ựựng hỗn hợp dung dịch trên trong lọ thuỷ tinh có nút mài tối màu, bảo quản nơi khô ráo, trong bóng tối ở nhiệt ựộ phòng. Dung dịch Lactofenol Amann khi mới pha thì không màu, nhưng ựể lâu dung dịch chuyển sang màu nâu nhưng vẫn dùng ựược.
● Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử
- Chuẩn bị mẫu
Mẫu thực phẩm ựược cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong ựiều kiện vô trùng cho tới khi ựược thể ựồng nhất.
- Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10-1
Cân chắnh xác 25g thực phẩm ựã ựược chuẩn bị (hoặc hút 25ml thực phẩm lỏng), cho vào bình nón chứa sẵn 225ml nước thạch 10 / 00 . Lắc ựều 2-3 phút, thu
ựược dung dịch mẫu thử 10-1
- Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10-2 , 10-3, 10-4Ầ
Hút chắnh xác 1 ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9
ml nước thạch 10 / 00 . Lắc ựều trong 2-3 phút, thu ựược dung dịch 10-2. Tiếp tục
d. Phương pháp tiến hành
Bước 1 : Nuôi cấy mẫu
- Ghi ký hiệu mẫu và nồng ựộ dung dịch mẫu thử lên hộp lồng.
- Dùng pipet 1 ml vô trùng, hút chắnh xác 1 ml từ dung dịch mẫu thử ở từng ựậm ựộ cho vào giữa mỗi hộp lồng. Mỗi mẫu thực phẩm phải ựược nuôi cấy ắt nhất 3 ựậm ựộ pha loãng. Mỗi ựậm ựộ pha loãng phải ựược nuôi cấy trong 2 hộp lồng vô trùng và dùng 1 pipet 1 ml vô trùng riêng.
- đun nóng chảy thạch Sabouraud, ựể nguội ựến 45 ổ 1oC. Trong ựiều kiện
vô trùng chỉnh pH của thạch ựến 4,5 ị 5,5 bằng dung dịch axit lactic 20 % , hoặc 40 % , hay bằng dung dịch axit xitric 20 % .
- Rót vào từng hộp lồng 12 ị 15 ml thạch Sabouraud, trộn ựều dung dịch mẫu thử với thạch bằng cách xoay tròn sang phải và sang trái 3 lần.
- để các ựĩa thạch ựông tự nhiên trên mặt phẳng ngang. Sau ựó ựể các ựĩa
thạch vào tủ ấm 28 ổ 1oC hoặc nhiệt ựộ phòng thắ nghiệm tương ứng trong 5 ngày.
Không lật ngược các ựĩa.
Lưu ý: Thời gian từ khi bắt ựầu pha loãng mẫu thử ựến khi rót thạch vào hộp lồng không ựược quá 30 phút.
Bước 2 : Sơ bộ nhận ựịnh kết quả
- Chọn các ựĩa có không quá 50 khóm nấm ựể sơ bộ ựọc kết quả.
- đếm và ghi lại số khóm nấm nghi ngờ là A.flavus (có màu xanh lục hoặc
vàng lục) ở từng ựậm ựộ. Sau ựó dùng que cấy nhọn ựầu lấy một ắt bào tử cấy ba
ựiểm cách ựều nhau trên ựĩa thạch Czapek, ủ ấm 28 ổ 1oC trong 5 ngày. Không lật
ngược các ựĩa.
- đếm và ghi lại số khóm nấm nghi ngờ là A.niger (có màu ựen, hoặc nâu
thẫm lấm tấm như bã cafe) ở từng ựậm ựộ. Sau ựó dùng que cấy nhọn ựầu lấy một ắt
bào tử cấy ba ựiểm cách ựều nhau trên ựĩa thạch Czapek, ủ ấm 28 ổ 1oC trong 5
- đếm và ghi lại số khóm nấm nghi ngờ là A.fumigatus (có màu xanh lá cây ựậm hay còn gọi màu ám khói) ở từng ựậm ựộ. Sau ựó dùng que cấy nhọn ựầu lấy
một ắt bào tử cấy ba ựiểm cách ựều nhau trên ựĩa thạch Czapek, ủ ấm 28 ổ 1oC trong
5 ngày. Không lật ngược các ựĩa.
- đếm và ghi lại số khóm nấm nghi ngờ là A.parasiticus (có màu xanh lá cây,
hơi vàng) ở từng ựậm ựộ. Sau ựó dùng que cấy nhọn ựầu lấy một ắt bào tử cấy ba
ựiểm cách ựều nhau trên ựĩa thạch Czapek, ủ ấm 28ổ1oC trong 5 ngày. Không lật
ngược các ựĩa.
- đếm và ghi lại số khóm nấm nghi ngờ là A. versicolor (có nhiều màu, viền
ngoài màu trắng rồi ựến màu xanh lục, ở giữa màu nâu hững. đôi khi có mảng màu vàng hoặc màu hồng) ở từng ựậm ựộ. Sau ựó dùng que cấy nhọn ựầu lấy một ắt bào
tử cấy ba ựiểm cách ựều nhau trên thạch Czapek, ủ ấm ở 28ổ1oC trong 5 ngày.
Không lật ngược các ựĩa.
Bước 3 : định danh
để xác ựịnh tên nấm mốc, từ những khóm nấm trên thạch Czapek tiến hành nhận xét ựại thể, vi thể.
đại thể: Bằng mắt thường, hay dùng kắnh lúp cầm tay ta nhận xét về kắch thước, màu sắc Ầ của khóm nấm.
Vi thể: để nhận xét nấm mốc về vi thể phải làm tiêu bản nấm mốc, rồi quan sát hình thái học dưới kắnh hiển vi ở vật kắnh 10, 40. Có thể chọn 1 trong 2 cách sau ựể làm tiêu bản nấm mốc:
Cách 1 : Lấy một lam kắnh sạch, trong, ựã sấy khô. Nhỏ 1 giọt Lactophenol Amann lên giữa lam kắnh. Dùng que cấy nhọn ựầu lấy một phần khóm nấm mọc trên ựĩa thạch Sabouraud (cả phần mọc trên và dưới mặt thạch) ựể vào giọt dung dịch Lactophenol Amann. Dùng kim có cán hay que cấy nhọn dìm nấm vào giọt dung dịch Lactophenol Amann ựể thấm ướt. Khi nấm bị thấm ướt hoàn toàn thì ựậy lá kắnh lên trên và ép nhẹ.
Lưu ý:
- Khi ựậy lá kắnh ựừng ựể có bọt khắ, nếu có sẽ gặp khó khăn trong khi soi kắnh.
- Khi ép nhẹ lá kắnh, nên dùng giấy thấm bớt dung dịch Lactophenol Amann thừa ựể dung dịch không tràn lên trên mặt lá kắnh.
Cách 2 : Lấy một lam kắnh sạch, trong, ựã sấy khô. Lấy một ựoạn giấy bóng kắnh có kắch thước rộng khoảng 1cm, dài khoảng 2-3cm, rồi chạm vào khóm nấm mọc trên ựĩa thạch Sabouraud sao cho lấy ựược toàn bộ hình thái của nấm (từ tế bào chân ựế ựến hạt ựắnh). Sau ựó trải dài giấy bóng kắnh trên lam kắnh.
Xác ựịnh tên nấm mốc theo thường quy dựa vào các ựặc ựiểm ựại thể và vi thể như bảng 3.4:
Bảng 3.4: đặc ựiểm hình thái các loài nấm Aspergillus
Tên nấm
mốc đại thể Vi thể
A.flavus Khóm nấm mốc có ựường kắnh d = 3 ị 5 cm trên thạch Czapek sau 5 ngày. Khóm nấm lúc ựầu hơi vàng, cuối cùng trở nên xanh lục hoặc vàng lục, ựôi khi hoá nâu khi già.
Bông lớn hình cầu, hình tia, ựôi khi tạo thành những cột không rõ rệt. Bọng hình cầu ựến gần cầu. Thể bình 1 hoặc 2 tầng, ở ựa số loài thể bình 2 tầng. Vách cuống conidi xù xì. Hạt ựắnh hình cầu ựến gần cầu, trơn hoặc có gai.
A.niger Khóm nấm mốc có ựường kắnh 4ị 5 cm trên thạch Czapek sau 5 ngày. Khóm nấm mốc màu ựen hoặc nâu ựen lấm tấm như bã cafe.
Bông hình cầu có màu ựen. Bọng hình cầu. Thể bình 1 hoặc 2 tầng, ở ựa số loài thể bình 2 tầng, Metulae dài gấp ựôi tầng Phialides. Vách cuống conidi trơn. Hạt ựắnh hình cầu ựến gần
cầu, có gai rõ.
A.fumigatus Khóm nấm mốc có ựường kắnh 3 ị 5 cm trên thạch Czapek sau 5 ngày. Khóm nấm có màu xanh lá cây ựậm hay còn gọi là màu ám khói.
Bông hình cột (hình trụ) dày ựặc, ựiển hình có ựường kắnh chỗ nào cũng ựều nhau ( vì chuỗi conidia kết lại tạo thành như những khúc trụ Ờ columnar). Bông non không có hình cột, thường có dạng gục xuống một bên. Trên cùng một khóm nấm mốc ta thấy ựược cả 2 loại hình ảnh bông này. Vách cuống conidi trơn. Bọng hình chuỳ rõ. Thể bình dứt khoát một tầng.
A.parasiticus Khóm nấm mốc có ựường kắnh d = 2 - 3 cm trên thạch Czapek sau 5 ngày nuôi cấy. Khóm nấm mốc có mầu xanh lá cây, hơi vàng. Không bao giờ hóa nâu khi già.
Bông nhỏ hình cầu, tỏa tia, bọng hình gần cầu. Thể bình 1 tầng, vách cuống conidi xù xì. Hạt ựắnh hình cầu, vách có gai.
A.versicolor Khóm nấm mốc có ựường kắnh 1 - 1,5 cm trên thạch Czapek sau 5 ngày nuôi cấy. Khóm nấm mốc có nhiều mầu khác. Ngoài cùng mầu trắng, rồi ựến mầu xanh lục, ở giữa mầu nâu hồng. Tùy theo các chủng khác nhau, ựôi khi có mảng mầu vàng, mầu hồng.
Bông nhỏ hình cầu, tỏa tia, bọng hình gần cầu ựến elip. Thể bình 2 tầng, vách cuống conidi trơn. Hạt ựắnh hình cầu, vách có gai.
- Phân tắch kết quả
để xác ựịnh tổng số bào tử nấm mốc có trong 1g (1ml) mẫu kiểm nghiệm, chọn những ựĩa có không quá 50 khóm nấm của 2 ựậm ựộ pha loãng liên tiếp. Sự phân bố các khóm nấm phải hợp lý: ựộ pha loãng càng cao thì số khóm nấm càng ắt. Kết quả ựược tắnh theo công thức sau: (52 TCN-TQTP 0001:2003 và 52 TCN-TQTP 0009:2004)
N = C / ( n 1 + 0,1 x n 2 )x d
C : Số khóm nấm mốc ựếm ựược trên các ựĩa ựã chọn. n 1 , n 2 : Số ựĩa ở 2 ựậm ựộ pha loãng liên tiếp. d: Hệ số pha loãng của ựậm ựộ pha loãng thấp hơn.
1. Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 ựậm ựộ lớn hơn 2 lần thì lấy giá trị ở ựậm ựộ pha loãng thấp hơn ựể tắnh kết quả bằng cách tắnh trung bình cộng.
2. Nếu 2 ựĩa của ựậm ựộ pha loãng ban ựầu có ắt hơn 5 khóm nấm thì tắnh kết quả theo trung bình cộng.
Phương pháp xử lý số liệu