VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 đối tượng nghiên cứu
Kháng thể kháng Newcatle của ựàn gà thả ựồi nuôi hướng thịt tại huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang (độ tuổi gà từ 1 ựến 100 ngày tuổi).
3.2 Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát kháng thể Newcastle của ựàn gà thả ựồi nuôi hướng thịt tại huyện Tân Yên, Bắc Giang trước và sau khi sử dụng vacxin.
- Xác ựịnh thời ựiểm dùng liều vacxin Newcastle ựầu tiên cho ựàn gà thả ựồi nuôi hướng thịt tại huyện Tân Yên, Bắc Giang.
- đề xuất lịch sử dụng vacxin Newcastle thắch hợp cho ựàn gà thả ựồi nuôi hướng thịt tại huyện Tân Yên, Bắc Giang.
3.3 Nguyên liệu nghiên cứu
* Vacxin Newcastle :
- Vacxin Lasota: do Xắ nghiệp thuốc thú y trung ương sản xuất, mỗi liều vacxin chứa tối thiểu106 EID50 virut Newcastle.
- Vacxin Medivac ND Lasota: do công ty Medivac, Indonesia sản xuất, mỗi liều chứa ắt nhất 107 EID50 virut Newcastle.
- Vacxin Newcastle: do Xắ nghiệp thuốc thú y trung ương sản xuất, có chứa ắt nhất 106 EID50 virut nhược ựộc Newcastle ựông khô chủng Mukteswar.
- Vacxin ND ỔSỖ: do công ty MVP, Malaysia sản xuất, có chứa ắt nhất 107 EID50 virut nhược ựộc Newcastle ựông khô chủng Mukteswar.
* Huyết thanh gà :
Huyết thanh của gà ựồi nuôi hướng thịt chưa và ựã sử dụng vacxin Newcastle
* Hồng cầu gà :
Hồng cầu lấy từ máu gà trống khỏe mạnh, có phản ứng HI âm tắnh. Sử dụng hồng cầu 1%
* Dung dịch PBS vô trùng có pH = 7,2 * Bộ dụng cụ Micropipette
* Tấm nhựa vi ngưng kết (Microtiter plates) 96 lỗ, ựáy hình chữ U, dung tắch mỗi lỗ 0,1 ml kiểu Takatsi
* Các loại hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị dùng trong phòng thắ nghiệm (của Phòng huyết thanh, Trung tâm chẩn ựoán và cố vấn Thú y, Công ty cổ phần chăn nuôi C.P. Việt Nam).
Tất cả các xét nghiệm huyết thanh ựều ựược thực hiện tại Phòng huyết thanh, Trung tâm chẩn ựoán và cố vấn Thú y, Công ty cổ phần chăn nuôi C.P. Việt Nam.
3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp lấy mẫu huyết thanh
- Lấy máu của gà thả ựồi nuôi hướng thịt trước và sau khi sử dụng vacxin Newcastle, chắt lấy huyết thanh.
- Cách lấy máu :
+ Gà con 1 ngày tuổi cắt ựộng mạch cổ lấy máu
+ Gà từ 4 ngày tuổi trở lên dùng seringe lấy máu tĩnh mạch cánh, cho vào ống epandof, ựặt nằm nghiêng cho máu ựông. Dùng seringe 1ml hút lấy phần huyết thanh. Bảo quản huyết thanh ở nhiệt ựộ âm 200C.
3.4.2 Phương pháp làm phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (Hemagglutination Inhibition test Ờ HI) ựể phát hiện kháng thể (Hemagglutination Inhibition test Ờ HI) ựể phát hiện kháng thể Newcastle
Virut Newcastle có ựặc tắnh gây ngưng kết hồng cầu gà, phản ứng HI dựa trên hiện tượng ức chế ngưng kết hồng cầu của virut Newcastle, bằng
kháng thể ựặc hiệu : kháng thể trung hòa virut, làm cho virut mất khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà.
Muốn làm phản ứng này, trước hết phải làm phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (phản ứng HA), ựể xác ựịnh 8 ựơn vị ngưng kết dùng trong phản ứng HI. Hai phản ứng này ựược tiến hành trên tấm nhựa vi ngưng kết (Microtiter plates) 96 lỗ, ựáy hình chữ U, dung tắch mỗi lỗ 0,1 ml kiểu Takatsi.
3.4.2.1 Phản ứng ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination test Ờ phản ứng HA)
* Nguyên lý: Trên bề mặt của virut Newcastle có kháng nguyên HN có khả năng gắn với thụ thể của hồng cầu gây ngưng kết hồng cầu, ta có thể quan sát ựược hiện tượng này bằng mắt thường.
* Nguyên liệu:
- Sử dụng hồng cầu gà 1% - Dung dịch PBS có pH = 7,2 - Bộ dụng cụ micropipette
- Tấm nhựa vi ngưng kết (Microtiter plates) 96 lỗ, ựáy hình chữ U, dung tắch mỗi lỗ 0,1 ml kiểu Takatsi.
*Tiến hành phản ứng:
- Nhỏ 50 ộl PBS vào các lỗ giếng từ lỗ 1 ựến lỗ 12
- Nhỏ 50 ộl kháng nguyên Newcastle vào giếng 1, tiếp tục pha loãng kháng nguyên theo cơ số 2. Chuyển 50 ộl từ lỗ 1 sang lỗ 2, trộn ựều. Hút 50 ộl từ lỗ 2 sang lỗ 3. Tiếp tục làm như vậy cho ựến lỗ 11 rồi hút bỏ ựi 50 ộl.
- Lỗ 12 làm ựối chứng chỉ chứa 50 ộl PBS
- Nhỏ 50 ộl dung dịch hồng cầu gà vào tất cả các lỗ giếng, ựể 45 phút ở
nhiệt ựộ phòng (25 o
C), rồi ựọc kết quả.
* đọc kết quả:
- Phản ứng dương tắnh: Hồng cầu bị ngưng kết nằm rải ựều thành từng mảng ở ựáy lỗ
- Hiệu giá phản ứng HA: là ở ựộ pha loãng virut cao nhất mà ở ựó vẫn còn hiện tượng ngưng kết hồng cầu. Người ta gọi ựó là 1 ựơn vị HA
- Phản ứng âm tắnh: hồng cầu bị lắng xuống ựáy thành cục tròn ựỏ, nước bên trên trong, giống như ở lỗ giếng ựối chứng
3.4.2.2 Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (Hemagglutination Inhibition test Ờ HI)
* Nguyên liệu:
- Kháng nguyên Newcastle có 8 ựơn vị HA - Kháng thể Newcastle chuẩn làm ựối chứng - Huyết thanh cần kiểm tra
- Bộ dụng cụ Micropipette
- Tấm nhựa vi ngưng kết (Microtiter plates) 96 lỗ, ựáy hình chữ U, dung tắch mỗi lỗ 0,1 ml kiểu Takatsi.
- Dung dịch PBS có pH = 7,2 - Dung dịch hồng cầu gà 1% * Tiến hành phản ứng:
- Nhỏ 50 ộl PBS vào các lỗ giếng từ lỗ 1 ựến lỗ 12 của ựĩa 96 giếng
- Nhỏ 50 ộl huyết thanh cần kiểm tra vào lỗ giếng ựầu, tiếp tục pha loãng theo cơ số 2 ựến hết giếng thứ 12, hút bỏ ựi 50 ộl
- Nhỏ 50 ộl kháng nguyên ựã pha 8HA vào các giếng từ lỗ 1 ựến lỗ 12,
nhắc nhẹ tấm nhựa. để 45 phút ở nhiệt ựộ phòng (25 o
C)
- Nhỏ 50 ộl dung dịch hồng cầu gà, ựể 45 phút ở nhiệt ựộ phòng (25 o
C) - Làm ựối chứng:
+ đối chứng dương: cho 50 ộl dung dịch PBS và 50 ộl hồng cầu gà 1%. + đối chứng âm: cho 50 ộl kháng nguyên và 50 ộl hồng cầu gà 1%.
+ Phản ứng dương tắnh: hồng cầu lắng xuống ựáy lỗ thành cục tròn ựỏ, nước bên trên trong.
+ Hiệu giá của phản ứng HI: là ựộ pha loãng huyết thanh cao nhất mà ở ựó vẫn còn khả năng ức chế ngưng kết hồng cầu
+ Phản ứng âm tắnh: hồng cầu bị ngưng kết nằm rải ựều thành mảng ở ựáy lỗ
+ Công thức tắnh tỷ lệ bảo hộ cá thể với virut Newcastle: Số mẫu có hiệu giá kháng thể ≥3log2
Tỷ lệ bảo hộ % = x 100% Tổng số mẫu kiểm tra
3.4.3 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu ựược từ kết quả nghiên cứu ựược xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học (Ngô Như Hòa, 1981) và chương trình excel 2003 trên máy tắnh.