Áp dụng đối với các KN mang điện tích:
- Định tính kháng nguyên đặc hiệu với mẫu kháng thể hòa tan trong bản gel.
- Định lượng kháng nguyên đặc hiệu với mẫu kháng thể hòa tan trong bản gel. Xây dựng đường chuẩn với các nồng độ kháng nguyên chuẩn. Từ đường chuẩn có thể xác định nồng độ chưa biết của cùng kháng nguyên.
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
- Quy trình xác định hàm lượng kháng nguyên Vi có trong vắc xin thương hàn Vi bằng kỹ thuật điện di miễn dịch tên lửa.
- Nguồn điện di Thermo EC105 (USA), model: 105 ECA – LVD.
2.2 Vật liệu nghiên cứu
2.2.1 Kháng nguyên Vi chuẩn
Kháng nguyên Vi nội bộ (inhouse) của hãng Aventis Pasteur (Pháp), loạt
140301, đông khô, hàm lượng kháng nguyên Vi 20,25 µg ViPs/lọ.
2.2.2 Kháng thể kháng Vi
Kháng thể kháng Vi điều chế tại Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế loạt 01/11 đã được chuẩn hóa và cho phép sử dụng là chất chuẩn.
2.2.3 Mẫu vắc xin
- Vắc xin Typhim Vi của hãng Sanofi Pasteur, dùng đánh giá độ chính xác, độ mạnh, độ đặc hiệu của quy trình.
+ Loạt H0472 – 1, hạn sử dụng: 9/2014. + Loạt H0492 – 1, hạn sử dụng: 9/2014. + Loạt H0495 – 1, hạn sử dụng: 9/2014.
- Vắc xin Meningococcal B+C của Cu Ba loạt M12HD05.15, hạn sử dụng: 05/2013, dùng đánh giá độ đặc hiệu của quy trình.
2.2.4 Hóa chất
+ Sodium bacbital (C8H11O3N2Na): Hãng sản xuất Kanto (Nhật), loạt
206A4590 và loạt 206A5574.
+ Axit bacbituric (C4H4 N2O3): Hãng sản xuất Merck (Đức), loạt
+ Agarose: Hãng sản xuất Sigma (Mỹ), loạt 0912-36-6. + PBS: Hãng sản xuất Gibco (Mỹ), loạt 624218.
+ Dung dịch nhuộm màu (Brilliant blue R Staining Solution): Hãng sản xuất Sigma (Mỹ), loạt 024K4407.
+ Dung dịch tẩy màu (Destain Solution, Coomassie R-250): Hãng sản
xuất Bio-Rad (Mỹ), loạt 210007125.
2.2.5 Máy móc
+ Bể điện di Hoefer (Mỹ), model: HE99X – 15 – 1.5, dùng chứa bản gel trong môi trường có pH > 8.
+ Nguồn điện di Thermo EC105 (Mỹ), model: 105 ECA – LVD. + Máy đo pH Thermo orion (Mỹ), model: 720a, đã được hiệu chuẩn.
2.2.6 Dụng cụ
+ Ống đong thủy tinh Schott Duran (Đức).
+ Pi pét loại 100 – 1000 µl: Hãng Eppendorf, mã số 1854695, đã được hiệu chuẩn.
+ Pi pét loại 20 – 200 µl: Hãng Eppendorf, mã số 476444, đã được hiệu chuẩn.
+ Pi pét loại 0,5 – 10 µl: Hãng Eppendorf, mã số 4860672, đã được hiệu chuẩn.
+ Giọt nước thăng bằng.
+ Thước đo chiều cao cột tên lửa, độ chính xác 1/20 mm.
2.3 Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu mô tả trong phòng thí nghiệm.
2.3.1 Thiết kế nghiên cứu độ tuyến tính và vùng tuyến tính
Hầu hết trong các thử nghiệm định tính kết quả của thử nghiệm được xác định dựa vào mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất cần phân tích và giá trị trực tiếp đo được, đó là việc dựng đường chuẩn.
Đường chuẩn là yếu tố quyết định sự đúng đắn của kết quả phân tích, do đó nếu trong quá trình xây dựng đường chuẩn, những sai số lớn sẽ dẫn đến mất chính xác của kết quả. Đường chuẩn được thiết lập dựa vào độ tuyến tính và phải nằm trong vùng tuyến tính của quy trình. Vì thế, để đánh giá độ tuyến tính và vùng tuyến tính ta dựa vào các kết quả của việc dựng đường chuẩn.
2.3.1.1 Độ tuyến tính
* Cỡ mẫu
Sử dụng kháng nguyên Vi (inhouse) của hãng Aventis Pasteur (Pháp), loạt 140301 dựng đường chuẩn:
+ Sử dụng 5 độ pha chuẩn. + Mỗi độ pha nhỏ vào 3 giếng.
Thêm 202,5 µl PBS vào lọ mẫu chuẩn chứa 20,25 µg ViPs đông khô, được
dung dịch chứa 100 µg ViPs/ml (ddA).
Do hàm lượng Vi trong vắc xin thương hàn Vi từ 35 – 65 µg ViPs/ml, nên việc xây dựng đường chuẩn từ nồng độ 12,5 µg ViPs/ml đến 100 µg ViPs/ml là phù hợp. Từ ddA pha các dung dịch nồng độ chuẩn B, C, D, E có hàm
lượng 75,0; 50,0; 25,0; 12,5; (µg ViPs/ml).
+ Dung dịch B (ddB): 30 µl dd A + 10 µl PBS.
+ Dung dịch C (ddC): 30 µl dd A + 30 µl PBS.
+ Dung dịch D (ddD): 30 µl dd C + 30 µl PBS.
+ Dung dịch E (ddE): 30 µl dd D + 30 µl PBS.
Nhỏ 7 µl mỗi độ pha (ddA, ddB, ddC, ddD, ddE) vào mỗi giếng. Tiến
hành điện di, đo chiều cao cột tên lửa tương ứng của 5 nồng độ mẫu chuẩn trên.
Đánh giá sự tương quan tuyến tính giữa giá trị hàm lượng kháng nguyên Vi và chiều cao cột tên lửa, thông qua việc xác định hệ số tương quan (r).
Lập phương trình hồi quy tuyến tính cho đường chuẩn trong khoảng hàm lượng từ 12,5 µg ViPs/ml đến 100 µg ViPs/ml.
* Cách tính hệ số tương quan (r) ( )( ) ( ) (∑ − ) ∑ − ∑ − − = = = = n i i n i i n i i i y y x x y y x x r 1 2 1 2 1 Trong đó:
x: Chiều cao trung bình mẫu chuẩn.
xi: Chiều cao mẫu chuẩn ở từng độ pha loãng.
y: Hàm lượng kháng nguyên Vi trung bình mẫu chuẩn. yi: Hàm lượng kháng nguyên Vi ở từng độ pha loãng.
Từ hệ số tương quan, kiểm định độ tin cậy 95% của hệ số tương quan theo quy luật “Student” với (n – 2) bậc tự do.
Tính T = r 2 1 2 r n − − Tra t = t(n - 2; 0,025) = t(3; 0,025) = 3,182. Trong đó:
n: số nồng độ mẫu dựng đường chuẩn.
* Tiêu chuẩn đánh giá [12]
0 ≤ | r | < 0,3: x và y không tương quan tuyến tính.
0,3 ≤ | r | < 0,6: x và y có tương quan tuyến tính.
0,6 < | r | ≤ 1: x và y có tương quan tuyến tính chặt chẽ. Kiểm định độ tin cậy của hệ số tương quan:
+ T < t: Hàm lượng kháng nguyên Vi và chiều cao cột tên lửa không tương quan (độc lập với nhau) ở mức ý nghĩa α = 0,05 (p > 0,05). Quy trình không đạt độ tuyến tính.
+ T > t: Hàm lượng kháng nguyên Vi và chiều cao cột tên lửa có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ ở mức ý nghĩa α = 0,05 (p < 0,05). Quy trình đạt độ tuyến tính với độ tin cậy 95%.
2.3.1.2 Vùng tuyến tính
Ở đây nhóm nghiên cứu không xác định giới hạn toàn bộ vùng tuyến tính mà chỉ khẳng định rằng, trong khoảng 12,5 µg ViPs/ml đến 100 µg ViPs/ml của đường chuẩn, các hàm lượng kháng nguyên Vi chuẩn thu được theo phương trình hồi quy, đều đạt tính đúng và tính chính xác.
2.3.2 Thiết kế nghiên cứu độ đúng
2.3.2.1 Cỡ mẫu thử
- Thực hiện 6 lần, mỗi lần như nhau: + Dùng 3 độ pha khác nhau.
+ Mỗi độ pha thực hiện 3 lần trên cùng 1 mẫu (triplicate tests).
- Thực hiện bởi 1 nghiên cứu viên, ở 6 ngày khác nhau.
2.3.2.2 Dựng đường chuẩn
Dựng đường chuẩn từ 5 độ pha mẫu chuẩn: ddA, ddB, ddC, ddD, ddE.
2.3.2.3 Mẫu thử
Do hàm lượng kháng nguyên Vi của vắc xin từ 35 – 65 µg/ml, nên nhóm
nghiên cứu chọn mẫu có hàm lượng kháng nguyên chuẩn: 25; 50; 75 (µg
ViPs/ml) để đánh giá độ đúng.
2.3.2.4 Cách tính độ đúng
Sau khi dựng đường chuẩn, từ chiều cao tương ứng đo được, tính nồng độ
dung dịch chuẩn ở nồng độ 25; 50; 75 (µg ViPs/ml).
Kết quả thu được tính được độ chệnh (bias) theo công thức:
∆ = µ µ − x x 100 Trong đó: ∆: Độ chệnh (%)
x: Giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm (hoặc kết quả thử nghiệm)
µ: Giá trị thực đã biết Kiểm định giá trị trung bình lý thuyết
S2 = ∑ = − − n i x xi n 1 2 ) ( 1 1 Tính T = n S x 2 − µ Tra t = t(n – 1;α) = t(5; 0,05) = 2,015 với α = 0,05
(Tra bảng quy luật Student với (n – 1) bậc tự do)
Trong đó
µ: Giá trị thực của mẫu
x: Giá trị trung bình kết quả thu được
xi: Giá trị kết quả thu được lần thứ i
S2: Phương sai
n: Số lần thử nghiệm
2.3.2.5 Tiêu chuẩn đánh giá
Đối với từng giá trị thu được: Giá trị ∆ ≤ 30% [43].
Đối với các giá trị thu được: Kiểm định giá trị trung bình thu được và giá trị thực được chấp nhận cùng với khoảng tin cậy 95% của độ đúng chung cho các mẫu [12]:
+ T < t: Không có sự khác nhau về kết quả của giá trị trung bình thu được so với giá trị thực của mẫu với mức ý nghĩa α = 0,05 (p > 0,05).
+ T > t: Có sự khác nhau về kết quả của giá trị trung bình thu được so với giá trị thực của mẫu với mức ý nghĩa α = 0,05 (p < 0,05).
2.3.3 Thiết kế nghiên cứu độ chính xác
2.3.3.1 Tính lặp lại * Cỡ mẫu thử
Để tiết kiệm kháng nguyên chuẩn, chúng tôi dùng 3 loạt mẫu vắc xin. Thực hiện 6 lần thử nghiệm trên 1 loạt vắc xin.
Mỗi loạt vắc xin thực hiện kiểm định cùng phương pháp, trong cùng một phòng thí nghiệm, cùng người thao tác và sử dụng cùng một thiết bị, trong cùng ngày.
* Dung dịch chuẩn
Sử dụng kháng nguyên Vi đông khô inhouse của hãng Aventis Pasteur loạt 140301 dựng đường chuẩn. Cách pha để dựng đường chuẩn như pha dựng đường chuẩn đối với độ tuyến tính.
* Dung dịch mẫu thử
Mỗi loạt vắc xin làm mẫu thử có hàm lượng kháng nguyên Vi khác nhau, vì vậy sử dụng các loạt khác nhau để tăng tính khách quan của thử nghiệm trong việc xác định tính lặp lại của độ chính xác.
Sử dụng 3 loạt vắc xin Typhim Vi của hãng Sanofi Pasteur: Loạt H0472 – 1, loạt H0492 – 1, loạt H0495 – 1.
* Cách tính tính lặp lại. SD = S2
* Tiêu chuẩn đánh giá:
Các kết quả thu được nằm trong khoảng x ±2SD [22].
2.3.3.2 Tính chính xác trung gian * Cỡ mẫu thử
Thực hiện bởi 2 nhóm nghiên cứu, cùng 1 loạt vắc xin.
Mỗi nhóm nghiên cứu thực hiện 6 lần thử nghiệm (6 ngày khác nhau).
Sử dụng kháng nguyên Vi đông khô inhouse của hãng Aventis Pasteur loạt 140301 dựng đường chuẩn. Cách pha để dựng đường chuẩn như pha dựng đường chuẩn đối với độ tuyến tính.
* Dung dịch mẫu thử
Sử dụng 1 loạt vắc Typhim Vi của hãng Sanofi Pasteur làm mẫu thử
* Cách tính tính chính xác trung gian
- Trong từng nhóm nghiên cứu: Tính x , SD.
- Trong 2 nhóm nghiên cứu:
+ Kiểm định so sánh phương sai giữa 2 nhóm thử nghiệm để đánh giá độ tản mạn của 2 dãy số liệu với độ tin cậy 95% [12].
Tính F = 2 2 Y X S S (với 2 X S > 2 Y S ) Tra f = f(n1 - 1; n2 – 1; 0,05)
(Tra bảng “quy luật Fisher – Snedecor") Trong đó:
2
X S , 2
Y
S : Phương sai kết quả của nhóm nghiên cứu 1, 2
n1, n2: số lần thực hiện thử nghiệm của từng nhóm
+ Kiểm định 2 giá trị trung bình để so sánh giá trị thu được trong hai nhóm nghiên cứu có như nhau không, với độ tin cậy 95% [12].
2 c S = 2 ) 1 ( ) 1 ( 2 2 − + − + − m n S m S n X Y T = m n S y x c 1 1 + − Trong đó: 2 c
S : Phương sai mẫu chung của 2 nhóm
x,y: Giá trị trung bình kết quả thu được của từng nhóm
Tra t = t(n + m – 2; α/2) = t(6 + 6 – 2; 0,025) = 2,228 (tra bảng “Quy luật Student với n bậc tự do”)
* Đánh giá kết quả
Trong từng nhóm nghiên cứu: Các kết quả thu được nằm trong khoảng:
x ± 2SD [22].
Trong 2 nhóm nghiên cứu: Tính phương sai, kiểm định so sánh phương sai, giá trị trung bình kết quả của 2 nhóm nghiên cứu với khoảng tin cậy 95% [12]:
+ F < f: Hai phương sai như nhau, nghĩa là độ tản mạn của kết quả thử nghiệm ở 2 nhóm như nhau với mức ý nghĩa α = 0,05 (p > 0,05).
+ F > f: Hai phương sai không như nhau, nghĩa là độ tản mạn của kết quả thử nghiệm ở hai nhóm khác nhau với mức ý nghĩa α = 0,05 (p < 0,05).
So sánh giá trị KN Vi trung bình thu được của hai nhóm với độ tin cậy 95%.
+ T < t: Giá trị KN Vi trung bình thu được của hai nhóm như nhau với độ tin cậy 95% (p > 0,05).
+ T > t: Giá trị KN Vi trung bình thu được của hai nhóm khác nhau với độ tin cậy 95% (p < 0,05).
Quy trình đạt tính chính xác trung gian nếu phương sai và giá trị trung bình của hai nhóm là như nhau với độ tin cậy 95% (p > 0,05)
2.3.4 Thiết kế nghiên cứu độ mạnh
2.3.4.1 Cỡ mẫu
Độ mạnh của quy trình đánh giá thông qua kết quả tính lặp lại và độ chính xác trung gian. Khi quy trình đạt tính lặp lại và độ chính xác trung gian thì quy trình đã đạt được độ mạnh.
Để thêm độ mạnh cho quy trình nhóm nghiên cứu đã thực hiện:
+ Trên 2 loạt Sodium bacbital: loạt 206A4590 và loạt 206A5574. Mỗi
loạt hóa chất tiến hành làm 6 lần thử nghiệm trên cùng mẫu thử. Chọn mẫu thử là vắc xin thương hàn Vi.
+ Thay đổi thể tích như nhau dung dịch kháng nguyên nhỏ vào mỗi giếng mẫu chuẩn và giếng mẫu thử trong một lần thử nghiệm: lấy thể tích 7, 8 µl/giếng. Thực hiện 6 lần thử nghiệm trên cùng mẫu thử. Chọn mẫu thử là vắc xin thương hàn Vi.
2.3.4.2 Cách tính và đánh giá độ mạnh
Cách tính và đánh giá độ mạnh giống như cách tính và đánh giá tính chính xác trung gian [12].
2.3.5 Thiết kế nghiên cứu độ đặc hiệu
Bản chất kỹ thuật điện di miễn dịch hình tên lửa gần giống kỹ thuật khuyếch tán miễn dịch đơn. Kháng thể được hòa trong bản gel, KN trong lỗ giếng di chuyển trong bản gel nhờ lực điện di. Chỉ những KN đặc hiệu KT hòa tan trong bản gel mới xảy ra hiện tượng ngưng kết.
Trong quy trình:
+ Bản gel có chứa sẵn kháng thể kháng Vi. + Mẫu được nhỏ vào giếng của bản gel.
Với kháng thể Vi thì chỉ có kháng nguyên Vi mới tạo ngưng kết KN – KT.
2.3.5.1 Cỡ mẫu
Sử dụng mẫu Typhim Vi, Meningococcal B + C, PBS làm mẫu thử/1 lần thử nghiệm. Thực hiện 6 lần thử nghiệm.
Để đánh giá khả năng thu được kháng nguyên Vi khi mẫu thử có các thành phần khác nhau, nhóm nghiên cứu chuẩn bị các mẫu thử như sau:
+ Vắc xin Typhim Vi pha loãng 1/2 bằng dung dịch mẫu chuẩn có hàm
lượng KN Vi 50 µg/ml (Mẫu thử 2). Nghĩa là mẫu thử 2 đã được thêm 25
µg/ml KN Vi so với mẫu thử 1.
Như vậy hàm lượng KN Vi mẫu thử 2 nhiều hơn mẫu thử 1 là 25 µg/ml.
+ Vắc xin Meningococcal B + C pha loãng 1/2 bằng PBS (Mẫu thử 3).
+ Vắc xin Meningococcal B + C pha loãng 1/2 bằng dung dịch mẫu
chuẩn có hàm lượng KN Vi 50 µg/ml (Mẫu thử 4). Nghĩa là mẫu thử 4 đã
được thêm 25 µg/ml KN Vi so với mẫu thử 3.
Như vậy hàm lượng KN Vi mẫu thử 4 nhiều hơn mẫu thử 3 là 25 µg/ml.
Nhỏ 7 µl mẫu chuẩn dựng đường chuẩn, mẫu thử 1, 2, 3, 4 và mẫu PBS (mẫu trắng) vào các giếng.
2.3.5.2 Cách tính kết quả
Tính hàm lượng KN Vi thu được ở các giếng mẫu thông qua việc đo được chiều cao cột tên lửa. Tính hàm lượng kháng nguyên Vi thêm thu được.
+ Mẫu thử 2 – Mẫu thử 1. + Mẫu thử 4 – Mẫu thử 3.
2.3.5.3 Đánh giá kết quả như đánh giá kết quả độ đúng
Đối với từng giá trị thu được: Giá trị ∆ không vượt quá ± 30% so với mẫu thử chứa 25 µg ViPs/ml [43].
Đối với các giá trị thu được: Tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn, kiểm định giá trị trung bình lý thuyết với khoảng tin cậy 95% của độ đúng chung cho các mẫu [12]:
+ T < t: Không có sự khác nhau về kết quả trung bình hiệu số thu được so với giá trị mẫu chuẩn thêm vào mẫu với mức ý nghĩa α = 0,05. Quy trình đạt độ đặc hiệu với độ tin cậy 95% (p > 0,05).
+ T > t: Có sự khác nhau về kết quả trung bình hiệu số thu được so với giá trị mẫu chuẩn thêm vào mẫu với mức ý nghĩa α = 0,05. Quy trình không đạt độ đặc hiệu với độ tin cậy 95% (p < 0,05).
2.4 Quy trình kỹ thuật
2.4.1 Đổ bản gel
- Sử dụng giọt nước thăng bằng để tạo mặt phẳng ngang.
- Hòa tan hoàn toàn 0,5 g thạch Agarose trong 40ml đệm Bacbital 1/2 bằng