2.1. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
2.1.1. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu để xây dựng qui trình xác định đồng thời paracetamol, phenylpropanolamin và clopheniramin maleat trong các mẫu thuốc Decolgen Forte PS bằng phương pháp trắc quang.
Nội dung nghiên cứu của đề tài tập trung vào các vấn đề sau:
- Khảo sát các điều kiện tối ưu và các yếu tố ảnh hưởng đến phép đo quang đối với paracetamol, phenylpropanolamin và clopheniramin maleat.
+ Môi trường.
+ pH tối ưu của dung dịch cho phép đo quang.
+ Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến độ hấp thụ quang. + Khảo sát sự ảnh hưởng nhiệt độ đến độ hấp thụ quang.
+ Ảnh hưởng của các cấu tử với nhau (kiểm tra tính cộng tính). + Rút ra kết luậ n về các điều kiện tối ưu cho phép đo quang để ứng dụng trong thực tế như : môi trường, thời gian dung dịch có độ hấp thụ quang ổn định, khoảng pH tối ưu .
- Đánh giá phương pháp phân tích.
- Khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khoảng tuyến tính khi xác định riêng rẽ từng cấu tử.
- Phân tích mẫu pha chế và mẫu thực tế.
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu
- Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho phép đo paracetamol, phenylpropanolamin và Clopheniramin maleat.
- Tiến hành xác định đồng thời 2 chất trong các mẫu giả tự pha . - Tiến hành xác định đồng thời 3 chất trong các mẫu giả tự pha .
- Tiến hành xác định đồng thời 3 chất trên trong mẫu thuốc Decolgen Forte PS.
- Sử dụng chương trình lọc Kalman để xác định đồng thời các cấu tử trong hỗn hợp.
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
2.2.1. Hóa chất
- Chất chuẩn paracetamol, phenylpropanolamin và clopheniramin maleat do viện kiểm nghiệm dược cung cấp.
- Các loại axit đặc: HCl, H2SO4, HNO3 của Merck.
- Các dung dịch NaOH, CH3COOH, Na2HPO4, KH2PO4, Na2B4O7, NH4Cl, NH3 đều pha từ hóa chất tinh khiết của Merck.
- Thuốc viên Declogen Forte PS được sản xuất bởi công ty UNITED PHARMA - Việt Nam
* Pha chế các dung dịch chuẩn.
- Dung dịch HCl, HNO3 có nồng độ 0,1M, 0,01M, 0,001M được pha từ ống chuẩn.
- Dung dịch H2SO4 có nồng độ 0,05M, 0,005M, 0,0005M được pha từ ống chuẩn.
- Pha dung dịch đệm axetat
pH = 4: Lấy 50 ml dung dịch NaOH 1M trộn với 285 ml dung dịch axit CH3COOH 1M, rồi định mức bằng nước cất thành 500ml.
pH = 5: Lấy 70 ml dung dịch CH3COONa 0,2M trộn với 30 ml dung dịch CH3COOH 0,2M rồi định mức bằng nước cất thành 500 ml.
- Pha đệm photphat
pH = 6: Lấy 30 ml Na2HPO4 11,8660 g/l và 220 ml KH2PO4 9,0780 g/l định mức bằng nước cất thành 250 ml.
pH = 7: Cân chính xác 14,612 g Na2HPO4.12H2O và 3,522 g KH2PO4 cho vào bình định mức 1 lít, hòa tan bằng nước cất, lắc đều rồi định mức đến vạch.
- Pha đệm Borat
pH = 8, Lấy 140 ml Na2B4O7 0,2M thêm 110 ml HCl 0,1M, định mức bằng nước cất thành 250 ml.
pH = 9: Hòa tan 3,092g H3BO3, 0,853g NaOH và 3,728g KCl trong 500 ml nước cất , lắc cho tan hoàn toàn , để nguội và định mức bằng nước cất thành 1 lít.
pH =10: Lấy 148 ml Na2B4O7 0,2M thêm 103 ml NaOH 0,1M định mức bằng nước cất thành 250 ml.
pH =11: Lấy 125 ml Na2B4O7 0,2M thêm 125 ml NaOH 0,1M định mức bằng nước cát thành 250 ml.
Các dung dịch đệm sau khi pha được kiểm tra và điều chỉnh bằng máy đo pH.
2.2.2. Dụng cụ, thiết bị
- Các dụng cụ thủy tinh như: Bình định mức thủy tinh, cốc thủy tinh, pipet các loại
- Máy quang phổ UV-VIS 1700 PC - Shimazu (Nhật Bản) có kết nối máy tính, khoảng bước sóng từ 190- 900 nm, cuvet thạch anh chiều dày l = 1cm.
- Cân phân tích Scientech SA 210 độ chính xác 0,0001g.
2.3. Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích
2.3.1. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng.
2.3.1.1. Giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn phát hiện được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phát hiện phân biệt với tín hiệu nền. Trong phân tích trắc quang LOD tính theo phương trình hồi quy có công thức như sau:
y
3.S LOD =
Trong đó:
Sy: là độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên đường chuẩn.
B: độ dốc của đường chuẩn chính là độ nhạy của phương pháp trắc quang.
2.3.1.2. Giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn định lượng được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác, có ý nghĩa định lương với tín hiệu nền và đạt độ tin cậy tối thiểu 95% và thường người ta sử dụng công thức:
y
10.S LOQ =
B (2.2)
2.3.2. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp
- Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các hỗn hợp PAR , PPA và CPM tự pha chế thông qua sai số tương đối RE. Sai số tương đối của các phép phân tích đối với mẫu chuẩn tự pha chế thông qua việc tính tỷ số giữa độ sai lệch của nồng độ tính toán được với nồng độ thực đã biết của mẫu theo công thức:
Tinh toan 0 0 C - C RE% = .100% C (2.3) Trong đó:
RE% là sai số tương đối của phép xác định nồng độ các cấu tử. CTinh toan là nồng độ tính toán được từ chương trình lọc Kalman .
C 0 (µg/ml) là nồng độ đã biết của dung dịch PAR, PPA hoặc CPM trong hỗn hợp.
- Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các mẫu thuốc nghiên cứu thông qua độ thu hồi bằng phương pháp thêm chuẩn . Độ thu hồi (Rev) được tính theo công thức sau:
TC - C - Re = .100% a a C v (2.4)
Trong đó: CT: nồng độ (µg/ml) của dung dịch PAR, PPA hoặc CPM xác định được trong mẫu sau khi thêm chuẩn;
Ca: nồng độ (µg/ml) của dung dịch PAR, PPA hoặc CPM xác định được trong mẫu khi chưa thêm chuẩn .
a: nồng độ (µg/ml) của dung dịch chuẩn PAR , PPA hoặc CPM thêm vào mẫu (đã biết).
- Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (S) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD).
n n 2 2 i i i=1 i=1 -μ -C S = = k k C C (2.5) RSD .100 (%) S C (2.6) Trong đó: Ci là các giá trị nồng độ (µg/ml) của dung dịch PAR, PPA hoặc CPM tính được lần thứ i;
là giá trị nồng độ thực của mẫu;
C là giá trị nồng độ trung bình tính được sau n lần xác định; k là số bậc tự do.
2.3.3. Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê
Khoảng tin cậy của phép xác định nồng độ được tính theo công thức:
P,k
t .S X ± ε = X ±
n (2.7)
Trong đó: tP, k là hệ số phân bố chuẩn Student ứng với xác suất P và bậc tự do k được tra trong bảng;
X là giá trị trung bình của tập số liệu các kết quả nghiên cứu ; S là độ lệch chuẩn;
Chƣơng 3