• Đặc tính kháng khuẩn của chitosan được thể hiện trên các mặt sau:
Sau khi Allan, Kendra và Uchida phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của Chitosan và muối của nĩ, nhiều nhà nghiên cứu đã tiếp tục đi sâu vào khía cạnh này. Nhiều cơng trình đã được cơng bố và đã tạo ra nhiều cơ sở cho nhiều ứng dụng trong y học và nhiều lĩnh vực khác. Tại Việt Nam, hiện nay chưa cĩ nghiên cứu chính thức nào hoặc cĩ rất ít các cơng trình đề cập đến vấn đề này. Chitosan cĩ khả năng ức chế nhiều loại vi sinh vật khác nhau. Tùy vào đặc tính của chitosan, loại vi khuẩn và điều kiện nghiên cứu khác nhau, các tác giả đã cho những kết luận khác nhau.
Nghiên cứu của Wang, 1992, dung dịch chitosan pH 5,5 và ở nồng độ
1 - 1,5% thì ức chế hồn tồn S. aureus sau hai ngày. Chang cũng nhận thấy rằng
phù hợp với kết quả cĩ được của Darmadji và Izumimoto trong nghiên cứu về tác dụng của chitosan trong bảo quản thịt. Nhiều nghiên cứu trên một số chủng
vi khuẩn khác cũng cho kết quả tương tự. Simpson và cộng sự cho rằng Bacillus
cereus bị ức chế hồn tồn ở nồng độ 0,02% trong khi Escherichia coli và roteus vulgaris phát triển yếu ở nồng độ 0,005% và bị ức chế hồn tồn ở nồng độ lớn
hơn bằng 0,0075% nhưng Chang lại cho rằng Bacillus cereus chỉ cần 0,005% là
cĩ thể bị ức chế hồn tồn trong khi Darmadji và Izumimoto lại kết luận nồng độ
lớn hơn bằng 0,1% cho sự ức chế E. coli. Sự phát triển của Aspergillus niger bị
ức chế bởi chitosan nồng độ 0,1 - 5mg/ml ở pH = 5,4 nhưng nồng độ nhỏ hơn 2mg/ml lại khơng hiệu quả với sự phát triển của mốc và sự sản sinh aflatoxin và
Aspergillus parasiticus (Fang - 1994). Trong nghiên cứu khác, Cuera phát hiện ra N-cacboxymethyl Chitosan cĩ khả năng giảm sự sản sinh aflatoxin của
Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus đến 90% trong khi sự phát triển của nấm mốc giảm hơn 50%. Bảo quản táo bằng cách nhúng trong chitosan, Sarage đã kết luận rằng chitosan cĩ vai trị lớn trong việc giảm sự tác động của nấm mốc và kéo dài thời gian bảo quản táo khoảng 12 tuần. Nghiên cứu của Byung và
cộng sự cho thấy Cadida albicans bị ức chế lần lượt là 85, 82, 95 và 75% bởi
chitosan (D70 và D90) và các dẫn xuất là mono (2-methacryloyl) oxyethyl axit phosphat (Chitosan-g-MAP) và muối vinylsulphuric axit sodium (Chitosan-g-
VSS), cịn đối với Trychophyton violeum lần lượt là 55%, 70% và 90% (nghiên
cứu được thực hiện ở chitosan mơi trường pH = 5,75). Như vậy, dù cĩ khác nhau giữa kết quả nghiên cứu của các tác giả nhưng nhìn chung các thí nghiệm đều cho thấy chitosan và dẫn xuất của nĩ thể hiện đặc tính kháng khuẩn khá cao đối với vi khuẩn và nấm mốc.
Như vậy, đặc tính kháng khuẩn của chitosan là :
- Lấy đi từ các vi sinh vật này các ion quan trọng như Cu2+. Như vậy vi sinh
vật sẽ bị chết do sự thiếu cân bằng liên quan đến các ion quan trọng này (Muzzarelli, 1977).
- Gây ra sự rị rỉ các phần tử bên trong màng tế bào vi sinh vật.
- Gây ra sự tổ hợp polyelectrolyte với polymer mang tính chất acid trên bề mặt tế bào vi khuẩn.
• Cơ chế kháng khuẩn của chitosan:
Khả năng kháng khuẩn của chitosan và dẫn xuất của nĩ đã được nghiên cứu bởi một số tác giả, trong đĩ cơ chế kháng khuẩn. Mặc dù chưa cĩ một giải thích đầy đủ về khả năng kháng khuẩn đối với tất cả các đối tượng vi sinh vật, nhưng hầu hết đều cho rằng khả năng kháng khuẩn liên quan đến mức độ hấp phụ chitosan lên bề mặt tế bào. Trong đĩ, chitosan hấp phụ lên bề mặt vi khuẩn gram (-) tốt hơn vi khuẩn gram (+). Một số cơ chế đã được giải thích như sau:
- Nhờ tác dụng của những nhĩm NH3+ trong chitosan lên các vị trí mang điện
âm ở trên màng tế bào vi sinh vật, dẫn tới sự thay đổi tính thấm của màng tế bào. Quá trình trao đổi chất qua màng tế bào bị ảnh hưởng. Lúc này, vi sinh vật khơng thể nhận các chất dinh dưỡng cơ bản như glucose cho sự phát triển bình thường của nĩ, dẫn đến mất cân bằng giữa bên trong và bên ngồi màng tế bào, cuối cùng dẫn đến sự chết của tế bào. Theo giải thích của một số tác giả thì chính sự tác động giữa polycation chitosan sẽ liên kết với polyme mang tính acide (polyanion) trên bề mặt tế bào vi sinh vật tạo nên polyelectrolic đã gây khĩ khăn trong quá trình trao đổi chất.
- Chitosan cĩ thể cản trở và làm mất cân bằng sự phát triển của vi sinh vật do cĩ khả năng lấy đi các ion kim loại đĩng vai trị quan trọng trong thành phần
enzyme như Cu2+, Co2+, Cd2+… của tế bào vi sinh vật do sự tạo phức với nhĩm NH2
cĩ trong phân tử chitosan, đồng thời các nhĩm này cĩ thể tác dụng với các nhĩm anion của bề mặt thành tế bào. Như vậy vi sinh vật sẽ bị ức chế phát triển do sự mất cân bằng liên quan đến các ion quan trọng.
- Ở nồng độ cao bề mặt vi khuẩn cĩ thể bị bao vây gây nên sự bất động các tế bào và giảm sự phát triển của chúng. Chitosan mạch ngắn hoặc chitosan oligome
xâm nhập vào nội bào gây cản trở quá trình tổng hợp protein và các hợp chất nội bào khác.
- Điện tích dương của những nhĩm NH3+ của glucosamine monomer ở
pH < 6,3 tác động lên các điện tích âm ở thành tế bào của vi khuẩn, dẫn đến sự rị rỉ các phần tử ở bên trong màng tế bào. Đồng thời gây ra sự tương tác giữa sản phẩm của quá trình thuỷ phân cĩ khả năng khuếch tán bên trong tế bào vi sinh vật gây ức chế mARN và sự tổng hợp protein tế bào.
- Chitosan cĩ khả năng phá huỷ màng tế bào thơng qua tương tác của nhĩm
NH3+ với những nhĩm phosphoryl của thành phần phospholipid của màng tế bào vi
khuẩn. Quan sát dưới kính hiển vi sự phá hủy tế bào S. aureus, sự phân chia của tế
bào bị rối loạn, sự tạo thành tế bào khơng theo quy luật: Tế bào tạo thành khơng cĩ màng hoặc màng tế bào tạo thành rất mỏng gây nên sự rị rỉ các hợp chất nội bào.[4], [7], [8]
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Chitosan
Chitosan được cung cấp từ Trường Đại học Nha Trang cĩ các chỉ tiêu chất lượng như sau:
- Độ deacetyl (DD) : 70% - Trạng thái : dạng bột - Màu sắc : trắng - Độ ẩm : 8% - Khối lượng phân tử: 1900 kDa
2.1.2. Vi khuẩn
- Vi khuẩn gram (-) : E. coli
- Vi khuẩn gram (+): Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes
Do Bộ mơn Hĩa - Vi sinh – Khoa Cơng Nghệ Thực Phẩm – Trường Đại học Nha Trang cung cấp.
2.1.3 Mơi trường nuơi cấy PCA
Sử dụng mơi trường khơng chọn lọc PCA (Plate Count-Agar). Thành phần mơi trường (g/l): Pepton casein: 15g Pepton thịt : 5g NaCl : 5g Agar : 15g Xuất xứ: Hãng Merck – Đức. 2.1.4 NaCl - Độ tinh khiết : > 99,5%
- Nguồn gốc : Mua tại Cơng ty TNHH Hĩa chất – Thiết bị - Dụng cụ thí nghiệm Hồng Trang. Địa chỉ: 42 Hồng Hoa Thám, Nha Trang, Khánh Hịa.
2.1.5 Acide acetic
- Độ tinh khiết : > 99,5%
- Nguồn gốc : Mua tại Cơng ty TNHH Hĩa chất – Thiết bị - Dụng cụ thí nghiệm Hồng Trang. Địa chỉ: 42 Hồng Hoa Thám, Nha Trang, Khánh Hịa.
- Xuất xứ : Trung Quốc. 2.2 Máy mĩc thiết bị cần sử dụng
• Tủ cấy vi sinh. Xuất xứ: Hãng Memmert – Đức.
• Cân phân tích (chính xác đến 10-4 g). Xuất xứ: Nhật Bản.
• Nồi hấp thanh trùng. Xuất xứ: Hãng Sturdy Industrial – Đài Loan. • Tủ ấm. Xuất xứ: Hãng Memmert – Đức.
• Tủ sấy dụng cụ
2.3 Phương pháp nghiên cứu
Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Vi khuẩn
Pha lỗng vào các ống nước muối sinh lý
Bổ sung dịch vi khuẩn vào các ống nghiệm cĩ chứa chitosan, acide acetic đã chuẩn bị sẵn
Để ở điều kiện thường trong thời gian nhất định
Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ chitosan thích hợp để ức chế hồn tồn vi sinh vật
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ chitosan thích hợp để ức chế hồn tồn vi sinh vật
Vi khuẩn
Pha lỗng vào các ống nước muối sinh lý
Bổ sung dịch vi khuẩn vào các ống nghiệm cĩ chứa chitosan ở các nồng độ (ppm)
Để ở điều kiện thường trong thời gian 90 phút
Cấy trên mơi trường PCA và ủ trong 24 giờ rồi đọc kết quả
110 10 30 50 70 90
0
Vi khuẩn
Pha lỗng vào các ống nước muối sinh lý
Bổ sung dịch vi khuẩn vào các ống nghiệm cĩ chứa chitosan ở nồng độ đã chọn và các ống nghiệm đối chứng
Để ở điều kiện thường trong thời gian
Cấy trên mơi trường PCA và ủ trong 24 giờ rồi đọc kết quả 0 phút
Chọn được thời gian xử lý thích hợp
30 phút 60 phút 90 phút 120 phút
Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian xử lý thích hợp để ức chế hồn tồn vi sinh vật
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian xử lý thích hợp để ức chế hồn tồn vi sinh vật
Các bước tiến hành như sau: - Chuẩn bị dụng cụ:
Các dụng cụ như: Ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đũa thủy tinh, đầu pipet… rửa sạch, để ráo và được bao gĩi kín bằng giấy báo sau đĩ sấy vơ trùng ở
160oC/ 2 giờ. Riêng đầu pipet được xếp vào các hộp nhựa và được thanh trùng ở
121oC/15 phút.
- Chuẩn bị mơi trường:
Mơi trường PCA dạng bột được hịa tan trong nước cất với tỉ lệ 22,5g/l sau
đĩ tiến hành thanh trùng ở 121oC/15 phút trước khi sử dụng.
- Chuẩn bị dung dịch nước muối sinh lý ( NaCl 0,9%):
Dung dịch nước muối sinh lý được pha từ NaCl tinh khiết trong nước cất Tiến hành: Cân chính xác 0,9g NaCl tinh thể hịa tan vào 100ml nước cất. Dung dịch này được điều chỉnh về pH 6,15 sau đĩ được hút vào các ống nghiệm
(mỗi ống chứa 9ml) rồi được thanh trùng ở 121oC /15 phút trước khi dùng.
- Chuẩn bị dung dịch chitosan:
Dung dịch chitosan được pha ở các nồng độ khác nhau tùy theo từng thí nghiệm trong acide acetic 500ppm.
- Chuẩn bị vi khuẩn:
Ba chủng vi khuẩn nghiên cứu được cấy vào đĩa thạch được bảo quản ở điều kiện thích hợp.
- Tiến hành nuơi cấy
Các thao tác được tiến hành trong phịng cấy vi sinh để tránh bị nhiễm nhằm bảo đảm tính hiệu quả và khách quan.
Trước hết dùng cồn 70% lau sạch bề mặt bàn cấy, bật tia UV khoảng 15 phút để diệt hết vi khuẩn trên bề mặt sau đĩ tắt tia UV đợi 15 rồi vào cấy.
Pha lỗng vi khuẩn: Dùng que cấy đốt nĩng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn để vơ trùng, sau đĩ tiến hành lấy vi khuẩn từ đĩa thạch đã chuẩn bị sang ống nghiệm chứa
9ml NaCl 0,9% vơ trùng, nồng độ pha lỗng 10o, lấy 1 ml dịch vi khuẩn từ ống
nghiệm này bổ sung trực tiếp vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch NaCl 0,9 để đạt
nồng độ pha lỗng 10-1, tiếp tục lấy 1ml từ ống nghiệm này bổ sung trực tiếp vào
ống nghiệm chứa 9ml dung dịch NaCl 0,9% để nồng độ pha lỗng 10-2.
Sau đĩ lấy 1 ml dịch khuẩn từ ống nghiệm này bổ sung vào các ống nghiệm cĩ chứa 9ml dung dịch chitosan và các ống nghiệm đối chứng cĩ chứa 9ml acide
acetic 500ppm. Sau đĩ để các ống nghiệm này ở điều kiện thường trong các khoảng thời gian khác nhau. Tiến hành nuơi cấy trên mơi trường PCA. Dùng pipetmain lấy
1ml dịch ở các ống nghiệm trên (nồng độ pha lỗng 10-3) cho vào đĩa petri đã sấy
vơ trùng. Sau đĩ đổ khoảng 15 - 20ml mơi trường đã đun chảy và để nguội đến 40 –
45oC vào đĩa petri đã cấy mẫu. Xoay nhẹ đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim
đồng hồ (mỗi bên 5 vịng) để dung dịch mẫu trộn đều trong mơi trường cấy. Giữ ở
37oC trong 24 giờ rồi đếm số khuẩn lạc trên đĩa petri.
Đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan bằng cách so sánh lượng vi khuẩn trong mẫu chitosan và lượng vi khuẩn trong mẫu chứa dung dịch NaCl 0,9%. Phần trăm tế bào chết được xác định theo cơng thức:
% tế bào chết = % 100 dc cts dc CFU CFU CFU
Trong đĩ: CFUdc: là số khuẩn lạc trên mẫu đối chứng.
CFUcts: là số khuẩn lạc trên mẫu chitosan hoặc chitosan phân tử
lượng thấp.
Số khuẩn lạc trên các mẫu được xác định như sau:
V D A M i i i * Trong đĩ:
Ai: là số khuẩn lạc trung bình đếm được trên đĩa
Di: là nồng độ pha lỗng
V : là thể tích cấy (1ml) 2.4 Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu trên vi khuẩn gram (-)
E. coli
Để thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của chitosan từ xương mực, em đã tiến hành thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ chitosan và thời gian xử lý
trên vi khuẩn gây bệnh E. coli đại diện cho nhĩm gram (-) gây bệnh và thu được kết
quả như hình 3.1, 3.2, 3.3.
Hình 3.1. Hình ảnh kết quả kháng E. Coli
Mẫu cĩ chitosan ở nồng độ 50ppm sau 90 phút
e e d c b 0 20 40 60 80 100 120 10 30 50 70 90 110 Nồng độ chitosan (ppm) T ỷ l ệ E . co li b ị ứ c ch ế (% ) 90 phút a
Hình 3.2. Biểu đồ kết quả kháng E. coli của chitosan từ xương mực theo nồng
độ ở thời gian xử lý là 90 phút
Ta nhận thấy, khi cố định thời gian tác dụng ở 90 phút và thay đổi nồng độ
của chitosan thì thu được kết quả như sau: Tỷ lệ E. coli bị ức chế ở nồng độ chitosan
10ppm là 47,08%. Như vậy, cĩ thể thấy ở nồng độ chitosan là 10 ppm thì khả năng
ức chế đối với vi khuẩn E. coli vẫn cịn thấp. Tuy nhiên, ở các thí nghiệm tiếp theo
khi tăng nồng độ chitosan lên 30ppm, 50ppm, 70ppm, 90ppm thì tỷ lệ E. coli bị ức
chế tăng lên đáng kể. Sau 90 phút xử lý ở nồng độ chitosan là 50ppm - 90ppm cĩ tới
84,02 – 99,58% E. coli bị ức chế.
Khi nồng độ chitosan tăng thì tỷ lệ E. coli bị ức chế tăng, ở nồng độ chitosan
110ppm thì tỷ lệ E. coli bị ức chế là 100% chúng khơng thể phát triển được trên mơi
trường PCA.
Khi nồng độ tăng lên đồng nghĩa với mật độ nhĩm NH3+ tăng lên. Các nhĩm
này cĩ khả năng liên kết với các nhĩm amoni của thành tế bào và lấy đi các ion kim
loại cần thiết từ đĩ gây cản trở quá trình sinh trưởng và phát triển của E. coli. Thêm
vào đĩ khi nồng độ tăng lên thì bề mặt tế bào E. coli cĩ thể bị bao vây gây ra sự bất
động từ đĩ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của chúng. Điều này hồn tồn phù hợp với giải thích của các nghiên cứu đi trước về cơ chế của việc kháng khuẩn của
chitosan. Các tác giả cho rằng chính các nhĩm NH3+ của chitosan là nguyên nhân làm VSV bị tiêu diệt.
Tỷ lệ E. coli bị ức chế ở 2 nồng độ chitosan 90ppm và 110ppm cĩ sự tăng
dần từ 99,58% lên 100%, nhưng hiệu quả ức chế E. coli mà nồng độ 110ppm mang
lại khơng cao hơn nồng độ 90ppm. Vì vậy, ta chọn nồng độ chitosan để ức chế hồn