Thí nghiệm được nghiên cứu tại phòng Sinh học Phân tử, viện Ditruyền Nông nghiệp. Địa điểm gieo lúa thôn Tó, xã Tây Mỗ, huyện Từ Liêm, thành phố Hà Nội. Thời gian thực hiện từ 6/2013 đến 6/2014.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp thí nghiệm đồng ruộng
Bố trí thí nghiệm và đánh giá các chỉ tiêu theo phương pháp thí nghiệm đồng ruộng của Phạm Trí Thành (1986).
2.2.2. Các phƣơng pháp thí nghiệm trong phòng
a. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
DNA lúa được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp sử dụng CTAB cải tiến (của phòng thí nghiệm Di truyền học, Trường đại học Gent, Vương Quốc Bỉ).
Các bước tiến hành:
Phương pháp CTAB cải tiến trên cơ sở phương pháp của Shagai – Maroof (năm 1984). Tóm tắt quy trình thực hiện gồm các bước:
Lá của các giống lúa nghiên cứu được cắt lấy mẫu sau khi cấy 2 -3 tuần. Mẫu được lấy vào sáng sớm là lúc nồng độ muối trong lá thấp, các enzym hoạt động ít là điều kiện tốt để tách chiết DNA.
Nghiền mẫu cùng với nitơ lỏng trong eppendorf (hoặc cối) thành dạng bột mịn, khi nghiền luôn để mẫu trong nitơ lỏng.
Cho mẫu vào eppendorf 2ml và cho 1ml đệm chiết (100mM Tris HCl, pH 8): 500mM NaCl: 50mM EDTA, pH 8,0): 0,07% - Mercaptol ethanol)rồi đảo đều, giữ trong đá và thêm 50 l SDS 10%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Đặt vào nồi cách thủy ủ trong 30 phút ở 650C, 5 phút đảo 1 lần cho dịch được trộn đều.
Ly tâm 13500 vòng/phút trong 20 phút.
Lấy ra đổ dịch nổi ở phía trên sang một eppendorf mới. Thêm 1ml isopropanol alcohol rồi để vào tủ 40C cho kết tủa khoảng 30 phút (hoặc qua đêm) không để vào tủ lạnh sâu -200C vì sẽ gây hiện tượng kết tủa muối.
Ly tâm 13500 vòng/phút trong 25 phút.
Đổ hết dịch nổi ở trên rồi giữ lại tủa ở dưới đáy eppendorf. Cho 400 l đệm TE (10mM Tris HCl pH=8,0; 0,5 mM EDTA pH=8,0)cho vào tủ 650C ủ trong 5 phút. Dùng pipet nhỏ hoặc búng nhẹ hoà tan tủa, bước này có thể giữ ở 40C qua đêm.
Cho 3 l Rnase (10mg/ml) vào mỗi eppendorf. Ủ ở 37oC khoảng 3 tiếng. Thêm 400 l đệm CTAB (0,2M Tris HCl (pH 8,0): 2M NaCl: 0,05M EDTA (pH 8,0): 2% CTAB, đặt vào nhiệt độ 650C trong 15 phút, thỉnh thoảng trộn, lắc đều.
Cho và tủ hút, thêm vào 800 l chloroform/isoamyl alcohol (24:1), lắc trộn từ 5 – 7 phút nhằm loại bỏ protein.
Ly tâm ở 13500 vòng/phút trong 10 phút. Dung dịch bên trong eppendorf tách thành 2 phần. Sử dụng pipet hút chuyển dịch nổi ở phía trên sang một eppendorf mới. Nếu chưa sạch có thể chiết lại lần 2 bằng chloroform/isoamyl alcohol (24:1).
Thêm 2,5 lần thể tích ethanol 96% và giữ trong tủ lạnh sâu (-200 C). Ly tâm 13500 vòng/phút trong 30 phút, loại bỏ cồn để giữ lại tủa trắng ở đáy ống.
Rửa tiếp bằng 400 l cồn 70% rồi đưa vào máy ly tâm 13500 vòng/phút trong 5 phút. Dùng pipet rút bỏ cồn giữ lại tủa, cho vào máy làm khô chân
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
không khoảng 10 phút làm khô tủa (DNA), sau đó cho 100 l TE (10: 1) vào mỗi eppendorf hoà tan tủa.
Giữ DNA trong tủ lạnh sâu (- 200C) để sử dụng cho các bước nghiên cứu tiếp theo.
b. Phương pháp PCR với các chỉ thị thí nghiệm
Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR được chuẩn bị trong tấm PCR plate 96 giếng. Thành phần, hàm lượng của các chất trong mỗi phản ứng như sau:
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích ( l) 1 H2O cất khử trùng 8,95 2 Buffer 10X 1,5 3 MgCl2 (50mM) 0,45 4 dNTP (1mM) 1,0
5 Taq DNA polymeraza (5U) 0,1
6 Primer forward 5 M 0,5
7 Primer Revert 5 M 0,5
8 DNA (35ng/ l) 2,0
Tổng thể tích: 15
Sau khi đã có đủ thành phần, hàm lượng các chất cần thiết, tiến hành đặt chương trình chạy cho máy. Chu trình nhiệt trong máy PCR như sau:
Bảng 2.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Bƣớc Nhiệt độ (o
C) Thời gian (phút) Số chu kỳ
1 94 5 1
94 0,5
2 55* 0,5 35
72 1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
4 10 ∞ 1
(*): Nhiệt độ gắn mồi - có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi thí nghiệm
a. Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%
Các bước tiến hành
Cân 0.8g agarose, đong 100ml TBE 0,5X (5,4g Tris base; 2,76g axít boric; 2ml 0,5M EDTA, pH = 8,0) cho vào bình tam giác.
Hấp nóng trong lò vi sóng cho đến khi tạo thành một dung dịch đồng nhất. Để nguội đến khoảng 50 - 600
C, thêm 5 l ethidium bromide (10 mg/ml) và lắc đều.
Đổ dung dịch agarose vào khay sao cho không có bọt khí. Chờ khoảng 45 - 60 phút khi gel đông.
Rút lược, đặt gel vào bể điện di. Đổ 0,5X TBE ngập mặt gel khoảng 2mm. Tra sản phẩm PCR đã được trộn với Xylen cyanol vào giếngCác mẫu chạy với ladder 50 bp.
Soi gel trên máy soi cực tím.
b. Phương pháp điện di trên gel agarose 2,5%
Cân 10g agarose, đong 400ml TBE 0,5X (5,4g Tris base; 2,76g axít boric; 2ml 0,5M EDTA, pH = 8,0) cho vào bình thủy tinh 1lit.
Hấp nóng trong lò vi sóng cho đến khi tạo thành một dung dịch đồng nhất. Khuấy đều, thêm 20 l ethidium bromide (10 mg/ml) và lắc đều. Đổ dung dịch agarose vào khay sao cho không có bọt khí. Chờ khoảng 45 - 60 phút khi gel đông.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Tra sản phẩm PCR đã được trộn với Xylen cyanol vào giếng. Các mẫu chạy với ladder 50 bp.
Soi gel trên máy soi cực tím.
c. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính
Chuẩn bị kính
Lau kỹ bề mặt hai tấm kính 3 lần bằng nước cất, sau đó lau lại 3 lần bằng ethanol 95%, để khô sau mỗi lần lau.
Lau tấm kính dài với giấy lụa tẩm Rain-X . Để 5 phút cho khô dung dịch.
Chú ý. Tránh làm dính dung dịch này lên tấm kính ngắn.
Lau tấm kính ngắn với dung dịch dính (Binding solution) Để cho tấm kính khô, lau tiếp bằng ethanol 95% 1 lần.
Lắp ghép 2 tấm kính lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4mm.
Chuẩn bị gel polyacrylamide
Chuẩn bị dung dịch 4,5% acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide Đổ 60ml dung dịch 4,5% acrylamide. Bơm dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí.
Cài lược vào giữa hai tấm kính (răng lược hướng ra phía ngoài). Dùng kẹp cố định lược.
Để gel polyme hóa trong 1 - 2 giờ.
Điện di
Tháo lược và loại bỏ hết các mảnh gel thừa bám trên mặt tấm kính. Lắp ráp bộ điện di. Cho 1 lít đệm TBE 1X vào buồng đệm trên và dưới. Dùng xylanh đuổi hết bọt khí ở bề mặt phía trên của khuôn gel.
Chạy tiền điện di (prerun) với cường độ dòng điện là 50 - 60A, công suất 92 - 100W.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Biến tính các sản phẩm PCR ở 950C trong 5 phút, rồi ngay lập tức đặt vào trong đá và phủ đá lên trên ít nhất 5 phút.
Sản phẩm PCR lúc này đã được trộn với 4 l Sequencing Stop solution. Tra vào mỗi giếng 5 l sản phẩm PCR đã được làm biến tính, các mẫu chạy với ladder 50 bp.
Thời gian tra mẫu không kéo quá dài để gel không bị nguội đi nhiều. Tiến hành điện di với công suất 60W và ở 500C, thời gian chạy ngắn hay dài tùy kích thước từng mồi sử dụng.
Phương pháp nhuộm bạc
Sau khi chạy điện đi, tháo gỡ tấm kính bám gel và tiến hành các bước sau: Cố định gel: Đặt tấm kính vào khay sao cho mặt bám gel hướng lên trên, đổ dung dịch cố định/dừng phản ứng và để trong khoảng 30 phút. Sau đó lấy gel ra khỏi dung dịch. Chú ý giữ lại dung dịch này để dùng cho bước sau.
Rửa gel bằng nước cất 2 lần mỗi lần 5 phút. Cho gel vào dung dịch nhuộm, lắc nhẹ trong 30 phút. Thêm formaldehyd và sodium thiolsufat vào dung dịch hiện. Lấy gel ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa lại bằng nước cất trong 5 - 10 giây.
Đưa gel vào dung dịch hiện và lắc nhẹ đến khi các băng xuất hiện. Cho gel vào dung dịch cố định/dừng phản ứng ở trên trong 3 - 6 phút. Rửa lại gel bằng nước cất. Để gel khô tự nhiên sau đó ghi nhận kết quả.
2.2.3. Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu.
Số liệu được ghi nhận trong chương trình Excel và được xử lý bằng phần mền IRISTAT 5.0.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 3: KẾT QỦA NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả xác định chỉ thị phân tử đa hình tại vị trí QTL/gen Yd7 giữa giống Khang Dân 18 và giống KC25
3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Tách chiết DNA là bước đầu tiên khá quan trọng trong mọi nghiên cứu về sinh học phân tử. Nếu có DNA đủ độ tinh sạch là điều kiện tốt cho các bước nghiên cứu tiếp theo. Có nhiều phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA. Tùy theo từng loại cây và mục đích nghiên cứu mà có thể chọn những phương pháp tách chiết DNA khác nhau. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp tách chiết DNA bằng CTAB. Lá non 3 tuần
sau khi cấy của những giống nghiên cứu được thu để tách chiết DNA. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% cùng với DNA chuẩn. Nhuộm gel bằng dung dịch ethidum bromide và ghi nhận kết quả trên máy soi cực tím.Kết quả tách DNA được thể hiện ở hình 3.1 cho thấy các mẫu DNA của Khang Dân 18 và mẫu DNA của giống KC25 khi điện di trên gel Agarose 0.8% xuất hiện băng rõ, nét, gon, đọ sáng tương đương băng DNA nồng độ chuẩn. các mẫu DNA này đủ độ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.2. Kết quả xác định các chỉ thị phân tử đa hình tại vị trí QTL/gen Yd7
Đa hình giữa hai giống lúa có thể được phát hiện bằng chiều dài khác nhau của các đoạn lặp lại được khuyếch đại bởi phản ứng PCR khi sử dụng cùng một cặp mồi SSR. Việc nhận dạng đa hình DNA giữa các giống cho gen và nhận gen với chỉ thị liên kết chặt là điều kiện tiên quyết để có thể sử dụng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
chỉ thị phân tử nhằm phát hiện sự có mặt của gen cần chuyển trong các cá thể con lai.
Dòng KC25 có mang gen quy định tăng số hạt trên bông Yd7. Nhằm
mục đích tìm kiếm chỉ thị có thể sử dụng để phát hiện gen Yd7 trong các cá
thể con lai chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với ADN của các giống lúaKhang Dân và KC25.
Sử dụng 6 chỉ thị SSR nằm ở vị trí của gen và về hai phía của gen Yd7 trên nhiễm sắc thể số 7.
Đã xác định được 3 chỉ thị cho đa hình giữa giống Khang Dân 18 và KC25 là RM445, RM500, RM21615. Kết quả được thể hiện qua hình 3.2. 3 0
Quan sát hình 3.2 ta thấy sản phẩm điện di ở chỉ thịRM445, RM500,RM21615đường chạy số 3- mẫu DNA của giống KC25 xuất hiện băng DNA cao hơn băng DNA ở đường chạy số 2 - mẫu DNA của giống Khang Dân 18.Sự chênh lệch về vị trí các băng DNA ở đường chạy 2 với đường chạy số 3 thể hiện đa hình giữa giống Khang Dân 18với giống KC25. Ba chỉthị phân tử đa hình liên kết chặt với QTL/gen Yd7 gồm chỉ thị RM445, RM500, RM21615 sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo nhằm xác định cá thể mang QTL/gen Yd7 trong quần thể F1, F2, F3....
3.2. Kết quả lai tạo thế hệ F1 của tổ hợp Khang Dân 18 và KC25
Bước đầu tiên để lai tạo các tổ hợp lai là tiến hành chọn cá thể để lai. Cá thể sử dụng cho lai tạo phải là cá thể có sức sống tốt, phát triển mạnh, không
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
sâu bệnh. Tiến hành khử đực cây nhận phấn Khang Dân 18. Sau khi khử đực toàn bộ bông lúa tiến hành cho thụ phấn với giống KC25. Chăm sóc cây lai, thu hạt lai khoảng 30ngày sau khi lai. Kết quả lai tạo tổ hợp F1 gữa giống khang Dân 18 và KC25 chúng tôi thu được 22 hạt lai. Kết quả lai tạo được thể hiện qua Hình 3.3.
3.3. Kết quả xác định cá thể mang QTL/gen Yd7 trong quần thể F1 của tổ hợp lai Khang Dân 18 và KC25 tổ hợp lai Khang Dân 18 và KC25
Lá lúa 2 tuần tuổi của các cá thể F1 được lấy mẫu dùng để phân tích DNA.
Kết quả xác định với chỉ thị RM500:Quần thể F1 của tổ hợp Khang Dân 18 và KC25 gồm 19 cá thể được kiểm tra bằng chỉ thị RM500.Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel Agarose 2,5% được minh họa bằng hình 3.4.
Hình 3.4: Kết quả điện di trên gel agarose 2,5% với chị thị RM500
Ghi chú: 1 – 19 cá thể F1; A: Khang Dân 18; B: KC25; H: dị hợp tử; L: ladder 50bp
Hình 3.4 cho thấy các cá thể F1 phân ly thành 2 dạng, dạng đồng hợp tử với Khang Dân 18 tại các cá thể số 11, 12, 15, 16, dạng dị hợp tử (có
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
gen cả bố lẫn của mẹ) tại các cá thể số 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 17, 18, 19.
Kết quả xác định với chỉ thị RM21615: Kiểm tra quần thể F1 với chị thỉ RM21615 cũng phân ly thành 2 dạng, dạng đồng hợp tử với Khang Dân 18 và dạng dị hợp tử. Kết quả cũng giống như khi sử dụng chỉ thị RM500 tại các cá thể số 11, 12, 15, 16 dạng đồng hợp tử. Các cá thể số 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 17, 18, 19. Dạng dị hợp tử được minh họa qua hình 4.6.
16
1
Hình 3.5: Kết quả điện di trên gel agarose 2,5% với chị thị RM21615
Ghi chú: 1 – 19 cá thể F1; A: Khang Dân 18; B: KC25; H: dị hợp tử; L: ladder 50bp
7 0
Kết hợp hai chỉ thị phân tử RM500 và RM21615ta xác định được 15/19
cá thể F1 (tổ hợp Khang dân 18 và KC25) mang kiểu gen dị hợp tử (của cả bố và mẹ) gồm cá thể số 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 17, 18, 19. Các cá thể này sẽ được tự thụ để tạo quần thể F2.
3.4. Kết quả xác định cá thể mang QTL/gen Yd7 trong quần thể F2 của tổ hợp lai Khang Dân 18 và KC25 tổ hợp lai Khang Dân 18 và KC25
Lá lúa 2 tuần tuổi của các cá thể F2 được lấy mẫu dùng để phân tích DNA. Để xác định các các thể mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông trong quần thể F2 chúng tôi sử dụng hai chỉ thị phân tử là RM21615 và RM500 liên kết chặt với QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông nhằm kiểm tra các cá thể trong quần thể F2. Hai chỉ thị phân tử có vị trí trên nhiễm sắc thể số 7 được liên kết chặt với QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông tại vị trí 15,910,595-15,910,767 bp và 18,249,927-18,250,057
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
bp (Temnykh-S và cs., 2011; “The map-based sequence of the rice genome”, Nature, 2005).
Kiểm tra quần thể F2 bằng chị thị RM21615
Kiểm tra quần thể F2 bằng chỉ thị RM21615, kết quả thu được 18/74 cá thể F2 cho đồng hợp tử tại vị trí locut của chỉ thị RM21615 liên kết với QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông (điểm B) gồm các cá thể số 2, 3, 6, 7, 8, 10, 11, 13, 16, 20, 23, 26, 28, 31, 33, 34, 36, 37. Kết quả được thể hiện ở hình 3.6.
0
Hình 3.6 : Kết quả điện di kiểm tra quần thể F2 với chỉ thị RM21615
L: Ladder 50bp, M: KD18, B: KC25, 1-74: các cá thể F2
Hình 3.6 cho thấy các cá thể F2 phân ly thành 3 dạng, dạng đồng hợp tử với Khang Dân 18 (điểm M), dạng dị hợp tử (điểm D) và dạng đồng hợp tử với KC25 (điểm B). Với chỉ thị RM21615 cho thấy những cá thể cho băng