Vector pGEM-T Easy có vùng 3’-T ở cả hai đầu đã tăng hiệu quả việc gắn gen endo-β-1,4-glucanase của T. asperellum PQ34 (sản phẩm PCR) vào vector khi khuếch đại PCR được tiến hành bằng enzyme Taq DNA- polymerase. Vị trí chèn gen endo-β-1,4-glucanase của T. asperellum vào vector pGEM-T Easy được trình bày ở hình 2.1. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp pGEM-T/EG vào chủng E. coli TOP10 được trình bày ở hình 3.4.
Hình 3.4. Kiểm tra sự hiện diện của (A) vector pGEM-T/EG và (B) gen endo-β- 1,4-glucanase của T. asperellum trong E. coli TOP10; MA và MB: thang DNA chuẩn (lambda/EcoRI+HindIII); 1A và 2A: vector pGEM-T/EG; 1B và2B: sản phẩm PCR.
Khi sử dụng cặp mồi EGF và EGR để khuếch đại gen endo-β-1,4- glucanase của T. asperellum PQ34 từ các vector tái tổ hợp (Hình 3.4A), chúng tôi đã thu được đoạn DNA có kích thước khoảng 1250 bp (Hình 3.4B), kết quả này chứng tỏ gen endo-β-1,4-glucanase đã được tạo dòng thành công trong tế bào E. coli.
Mặt khác, sử dụng enzyme hạn chế SacI cắt 2 vị trí nhận biết trên plasmid pGEM-T/EG, chúng tôi đã thu được 2 đoạn DNA với kích thước khoảng 1000 bp và khoảng 3200 bp (Hình 3.5), kết quả này trùng khớp với vị trí nhận biết của SacI trên trình tự gen endo-β-1,4-glucanase của T. viridae dùng để thiết kế mồi.
Hình 3.5. Kiểm tra sự tương đồng giữa gen endo-β-1,4-glucanase của T. asperellum với gen endo-β-1,4-glucanase của T. viridae bằng phản ứng cắt hạn chế. M: thang DNA chuẩn (lambda/ EcoRI+HindIII), 1: sản phẩm PCR cắt bằng
SacI. M 1 ~ 3200 bp ~ 1000 bp bp 21226 5148 2027 1375 947
Kết quả phân tích trình tự gen endo-β-1,4-glucanase của T. asperellum PQ34 được trình bày ở hình 3.6 cho thấy gen này có chiều dài 1.257 bp, tương đồng 52% so với trình tự của gen endo-β-1,4-glucanase của T. viridae.