2.2.4.1. Tách chiết genomic DNA
DNA tổng số của chủng nấm có hoạt độ endo-β-1,4-glucanase cao được tách chiết theo phương pháp phenol-chloroform (Siddiquee và cs, 2007).
Sợi nấm sau khi nuôi trên đĩa môi trường 1/5 PDA được cấy chuyển sang môi trường lỏng 1/5 PDA, nuôi 4 ngày ở 28oC, tốc độ lắc 150 rpm, sinh khối nấm được rửa 3 lần bằng nước cất, và sợi nấm sau đó được dùng để tách chiết DNA.
Một trăm miligam sinh khối sợi nấm được đồng nhất trong 500 µL đệm chiết DNA có bổ sung SDS (2-3%) và ủ ở 65oC trong 2 giờ, sử dụng hỗn hợp phenol:chloroform: isoamylalcohol (25:24:1, v/v) để kết tủa các thành phần không phải DNA. Dịch nổi chứa DNA được kết tủa bằng ethanol lạnh 100% và rửa lại 2 lần bằng ethanol lạnh 70%. Quá trình tinh sạch sử dụng máy ly tâm với tốc độ 13.000 rpm, trong 10 phút ở 4oC .
2.2.4.2. Khuếch đại gen bằng PCR
Sử dụng cặp mồi EGF (5'-GATAATATCTCCCCGTCATCGACAA-3') và EGR (5'-GAGAACAGACAGCCTCATAGAGTAG-3') được thiết kế cho gen mã hóa endo-β-1,4-glucanase của Trichoderma viride (accession No: AY343987) để khuếch đại vùng mã hóa của gen endo-β-1,4-glucanase của
Trichoderma asperellum.
Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm: 6 µL master mix (Gotaq Grean Master Mix 2×, Promega, Mỹ), 10 pmol mồi xuôi, 10 pmol mồi ngược, 50 ng DNA khuôn mẫu với tổng thể tích phản ứng là 12 µL. Quy trình PCR bao gồm: biến tính 95oC /5 phút; 30 chu kỳ: 95oC /1 phút, 50oC /1 phút, 72oC /1 phút, cuối cùng là 72oC /10 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên agarose gel 0,8% và nhuộm bằng ethidium bromide 0,05 %. Hình ảnh điện di được thu nhận bằng hệ thống thu nhận hình ảnh Gel Documentation và phân tích bằng phần mềm Quantity one 4.5 (Bio-Rad, Mỹ).